核雌激素受体配体结合域的晶体结构特性与功能

雌激素或类雌激素活性物质通过细胞核雌激素受体(nuclear estrogen receptor,n ER)通路发挥相应的生理性作用。当这些配体被n ER的配体结合域(ligand binding domain,LBD)识别后进入疏水性配体结合空腔内并引起受体构象发生改变,使得原先处于高度活动性的helix 12(H12)被固定从而进一步稳定空腔结构;同时n ER也能通过招募一系列辅助调节因子及其他共调节蛋白质,最终调控基因转录。但是,由于不同的配体和受体结合形成的晶体结构并不完全相同,导致这些复合体具有不同的性质,从而影响基因的转录活性。本文综述了n ER配体结合域及结合配体后形成的相应晶体结构与活性以及不同配体对受体结构和基因转录的影响。

雌激素受体ERβ配体结合区的异源表达与纯化

为研究环境化合物与雌激素受体的相互作用,在大肠杆菌中异源表达了人雌激素受体ERβ的配体结合区(hERβ-LBD)蛋白。在诱导剂(IPTG)浓度为0.2mmol.L-1,培养温度25℃,诱导时间为8h的优化表达条件下,经亲和色谱法纯化后,hERβ(LBD蛋白的产量可达236mg.L-1.

雌激素受体α及DNA结合域在宫颈病变中的研究进展

宫颈癌是一种发生在宫颈上皮的妇科恶性肿瘤,其是全球女性恶性肿瘤中最为常见的癌症之一。尽管采取各种预防措施,如HPV筛查和预防性HPV疫苗,在一定程度上降低了宫颈癌的发病率,但宫颈癌的转移和复发仍然是患者死亡的主要原因。除HPV感染外,雌激素及雌激素受体α(ERα)对宫颈病变的影响非常重要,同时,长期口服避孕药和多胎妊娠会增加宫颈癌发病的风险。越来越多研究表明,有多种miRNA参与调节ERα,进而促进宫颈癌的发生;且在宫颈癌中发现ESR1的突变,推测其参与着宫颈病变的发生与发展。转基因小鼠实验表明对ERαDNA结合域(DBD)的干扰可影响相关的基因转录,DBD区域突变的转基因鼠在雌激素作用下不会发生宫颈癌,因此,DBD区域可能成为宫颈病变早期诊断和临床治疗的新靶点。本文对ERα及其突变、miRNA调节以及DBD区域与宫颈病变相关方面的研究进展做一综述。

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体的制备和特性分析

目的:表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域β6LBD,并制备兔抗β6LBD多克隆抗体。方法:利用PCR方法扩增整联蛋白β6LBD基因片段,经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连入pGEX-4T-1原核表达载体,构建的pGEX-4T-1-β6LBD重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体,纯化目的蛋白。然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA方法测定抗体效价,并以Western blot鉴定其特异性。结果:SDS-PAGE电泳分析显示pGEX-4T-1-β6LBD诱导后表达一Mr约为42000的GST-β6LBD融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,用纯化GST-β6LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性。结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗猪源整联蛋白β6LBD多克隆抗体,为深入研究整联蛋白β6在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础。

牛口蹄疫病毒受体通用亚基αv配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

目的:利用原核细胞表达牛口蹄疫病毒受体通用亚基整联蛋白αv的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法:以含有牛整联蛋白全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到位于αv成熟肽氨基端的LBD基因片段,经酶切消化处理后,与同样酶切处理的原核表达载体pPRoEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRo/αvLBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达αvLBD蛋白。通过SDS-PAGE鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性。结果:成功构建了pPRo/αvLBD原核表达载体,实现了重组αvLBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其Mr约为40000,主要以包涵体形式存在于菌体中。制备的兔多克隆抗体效价达1∶25600以上。以Western blot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性。结论:实现了牛口蹄疫病毒受体通用亚基αvLBD的高效表达和高效价多克隆抗体的制备,为深入研究整联蛋白αv在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础。

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体的制备

以纯化的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域重组蛋白为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,制备口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体(McAb);采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,并用SDS-PAGE、间接ELISA以及间接免疫荧光法对制备的McAb的特异性进行鉴定。结果显示,成功获得5株能稳定传代并分泌抗β6亚基配体结合域的杂交瘤细胞株,分别命名为C4C7、E7C7、B8C9、C2D8和B7B6,其分泌的McAb为IgG2b(C2D8)和IgG2a(C4C7、E7C7、B8C9、B7B6)亚类。制备的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域McAb可为深入研究整联蛋白αvβ6在口蹄疫病毒感染过程中的作用奠定基础。

口蹄疫病毒受体羊源整联蛋白β6亚基配体结合域的原核表达、纯化及鉴定

利用原核细胞表达羊口蹄疫病毒(FMDV)受体整联蛋白β6亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白。以含有羊整联蛋白β6亚基全长cDNA的质粒为模板,PCR扩增得到β6LBD基因片段,经酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pPROEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRO/β6LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达重组羊β6LBD融合蛋白。SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达并利用镍离子亲和树脂对其纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot方法分析鉴定表达产物。成功构建了pPRO/β6LBD原核表达载体,实现了羊FMDV受体整联蛋白亚基β6LBD在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为33 kDa,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。用本试验室保存的抗FMDV受体猪源整联蛋白β6亚基LBD的单克隆抗体进行ELISA和Western blot检测,显示该单抗可与重组目的蛋白发生特异性反应,证明纯化后的蛋白与特异性抗体具有良好的特异性反应及抗原活性。为深入研究整联蛋白受体β6亚基在羊体内的分布及其在FMDV致病过程中的作用机制奠定了基础。

猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.

黄芪注射液对雌激素受体的激活作用研究

目的构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统,研究黄芪注射液对雌激素受体(ER)活性的影响。方法PCR扩增雌激素受体配体结合域,将配体结合域克隆到真核表达质粒pCMV-BD构建细胞杂交基因报告系统,研究黄芪注射液与雌激素受体的关系;MTT法检测黄芪注射液对细胞活力的影响。结果成功构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统,黄芪注射液不能提高细胞活性,但对雌激素受体具有激活作用。结论黄芪注射液可能通过雌激素受体发挥疗效,细胞杂交基因报告系统是研究中药作用机理的手段之一。

利用细胞杂交技术检测强骨胶囊对雌激素受体的影响

目的:探讨强骨胶囊对雌激素受体(ER)活性的影响。方法:将含有ERs配体结合域(LBD)的质粒pCMV-BD和pFR-Luci报告基因及内标质粒pFRTlaczeo共转染到Hela细胞中,检测强骨胶囊与雌激素受体的关系;MTT法检测强骨胶囊对细胞活力的影响。结果:低剂量(12.5ng/ml)的强骨胶囊对两种ER均无明显效果,但是高剂量(125ng/ml和1.25μg/ml)可以显著地激活ERs,并可以显著提高细胞活性。结论:强骨胶囊治疗骨质疏松的疗效可能与激活ERs的作用有关。

经前期综合征肝气郁证大鼠下丘脑ERβ的表达及配体受体结合活性的研究

目的探讨经前期综合征(PMS)肝气郁证发病的微观分子机理和中药经前舒颗粒对PMS肝气郁证的干预机制。方法雌性SD大鼠随机分为3组:正常对照组、模型组和经前舒组。慢性束缚应激法复制PMS肝气郁证大鼠模型,以经前舒颗粒进行药物干预。放射性配体受体结合技术测定下丘脑中雌激素受体β亚型(ERβ)的结合活性变化;Western blot技术检测下丘脑中ERβ蛋白的表达。结果与正常对照组比较,PMS肝气郁证模型组大鼠下丘脑中ERβ的配体受体结合活性、蛋白表达显著升高(P<0.05),而经前舒组可纠正其异常升高。结论下丘脑中ERβ表达量、配体受体结合活性的升高可能是导致PMS肝气郁证的重要病因;经前舒颗粒对下丘脑中ERβ表达、配体受体结合活性的异常变化有纠正作用。

雌激素受体β基因多态性与血脂水平的研究

目的:探讨中国人群雌激素受体β(ERβ)基因多态性的分布情况及其与血脂水平的关系。方法:采用PCR-RFLP技术检测湖北地区131例正常人的ERβ基因RsaI和AluI酶切多态性,同时检测血脂水平。结果:分析ERβ基因RsaI和AluI两个酶切位点的基因多态性,分别以Rr型、aa型最多,而以RR型、AA型最少,其分布在男女组间无显著性差异(P>0.05)。ERβRsaI和AluI不同基因型间血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、apoAI、apoB水平均有一定差异,但无统计学意义(P>0.05)。结论:ERβ基因RsaI和AluI酶切多态性可能不影响人群的血脂水平。

通络生骨胶囊对雌激素受体的激活作用

目的:构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统,研究通络生骨胶囊对雌激素受体(ER)活性的影响。方法:PCR扩增雌激素受体配体结合域,将配体结合域克隆到真核表达质粒pCMVBD构建细胞杂交基因报告系统,研究通络生骨胶囊与雌激素受体的关系;MTT法检测通络生骨胶囊对细胞活力的影响。结果:成功构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统,通络生骨胶囊可以显著提高细胞活性,并对雌激素受体具有激活作用。结论:通络生骨胶囊可能通过雌激素受体发挥疗效,细胞杂交基因报告系统可以用来研究中药的作用机理。

动脉中的雌激素受体与一氧化氮合酶活性的关系

目的 :探讨动脉壁中雌激素受体在雌激素调控一氧化氮合酶 (NOS)活性中的作用。方法 :用放射配体结合分析技术检测大鼠主动脉中雌激素受体的含量。离体主动脉条药物孵育法观察雌激素和受体拮抗剂tamoxifen对NOS活性的影响。结果 :1 雌性大鼠主动脉中存在雌激素受体。 2 1nmol17β 雌二醇作用 8h能使大鼠主动脉NOS的活性显著增强 (P <0 0 1)。 3 雌激素受体拮抗剂tamoxifen能显著抑制雌激素的上述作用 (P <0 0 1)。结论 :17β 雌二醇对血管NOS活性的影响由动脉壁中雌激素受体介导 ,该作用可能是雌激素降低血管阻力、抑制动脉粥样硬化作用的重要机理之一。

雌激素受体在喉癌组织中表达的研究进展

雌激素受体（estrogen receptor,ER）是类固醇激素受体超家族的成员之一,是一种配体依赖性转录因子,它与雌激素特异性结合,通过雌激素应答元件来调节基因的转录[1]。已知ER在乳腺癌,宫颈癌等女性肿瘤中起着重要作用。喉是性激素的靶器官。

骨科相关中药对雌激素受体的激活作用

目的构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统,研究骨科相关中药对雌激素受体(ER)活性的影响。方法PCR扩增雌激素受体配体结合域,将配体结合域克隆到真核表达质粒pCMV-BD构建细胞杂交基因报告系统,研究骨科相关中药与雌激素受体的关系;MTT法检测中药对细胞活力的影响。结果成功构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统,部分中药可以显著提高细胞活性,并对雌激素受体具有激活作用。结论中药治疗骨质疏松可能通过雌激素受体发挥疗效,细胞杂交基因报告系统可以用来研究中药的作用机理。

利用哺乳动物细胞双杂交体系研究仙灵骨葆对雌激素受体的作用

目的:利用哺乳动物细胞双杂交体系研究仙灵骨葆对雌激素受体(ERs)活性的影响。方法:通过MTT法检测仙灵骨葆对Hela细胞活力的影响,并构建含有ERs配体结合域(LBD)的质粒pCMV-BD及含有报告基因Lusferase的质粒pFR-Luci,将二者与内标质粒pFRTlaczeo共转染到Hela细胞中,形成Gal4DBD-ERa和ERb LBD细胞杂交报告系统。以染料木苷为阳性对照验证本杂交系统,并利用本系统考察仙灵骨葆对ERs活性的影响。结果:仙灵骨葆在25～2 500 ng·mL-1浓度范围内可以促进HeLa细胞的增殖。10μmol．L-1染料木苷可以显著提高Gal4DBD-ERα和ERβLBD细胞杂交报告系统中ERa和ERb的活性,证明本系统构建成功。仙灵骨葆对ERa具有浓度依赖性的激活作用,2500 ng·mL-1浓度时ERa的相对荧光活性是DMSO对照组的18倍;仙灵骨葆对ERb也具有一定的激活作用,2500 ng·mL-1浓度时ERb的相对荧光活性是DMSO对照组的4倍。结论:本研究成功构建了含有雌激素受体配体结合域的细胞杂交系统,仙灵骨葆对该系统的ERs具有激活作用。

不同性别大鼠心脏雌激素受体比较

目的比较雄性和雌性大鼠心脏中雌激素受体的表达情况并探讨其意义.方法用放射配体结合分析法检测雌性和雄性大鼠(各10只)心脏中雌激素受体的含量。结果雌性大鼠心脏雌激素受体为2.21±13(fmol·mg^(-1)·pro^(-1)),雄性大鼠心脏雌激素受体为2.03±0.11(fmol·mg^(-1)·pro^(-1)),两者比较无显著差异(P>0.05)。结论大鼠雄性与雌性之间心脏中雌激素受体含量无显著差异,两性冠心病发病率存在差异的原因可能与两性存在不同的雄性激素受体后信号转导途径有关。

昆虫蜕皮激素受体及其类似物的杀虫机制研究进展

昆虫的蜕皮、变态和繁殖受到蜕皮激素的严格调控。蜕皮激素作用靶标由蜕皮激素受体(ecdysteroidreceptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracleprotein,USP)组成,蜕皮激素与EcR/USP作用启动蜕皮级联反应过程。昆虫EcR具有种类或类群的特异性,研究其结构、功能和调控机理在开发环境友好型新药剂和基因调控开关等方面具有重要指导作用。该文介绍了昆虫EcR的结构和功能特点,蜕皮激素及其类似物与EcR/USP的分子作用方式,以及基于EcR/USP的新杀虫剂创制和基因调控开关设计等方面的重要进展。