基于免疫信息学技术的雏沙门菌多表位疫苗构建

【目的】设计针对雏沙门菌(Salmonella Pullorum)IpaJ蛋白的多表位疫苗(multi-epitope vaccine, MEV),为净化鸡白痢提供新的疫苗。【方法】选用IEDB预测雏沙门菌IpaJ蛋白的T淋巴细胞主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)类分子结合表位;用NetMHCIIpan 4.0 Server预测T淋巴细胞MHCⅡ类分子结合表位;用IEDB预测B淋巴细胞表位。将各个服务器预测结果筛选出的表位经过VaxiJen v 2.0评估抗原性后,将合格的表位通过柔性linker串联成多表位疫苗。对构建的多表位疫苗进行抗原性、理化性质、N-糖基化位点、二级结构和三级结构预测。使用分子对接评估多表位疫苗与免疫受体的结合能力,使用免疫模拟评估多表位疫苗的免疫效果,最后优化密码子便于克隆表达。【结果】经筛选后,选择4个MHCⅠ、4个MHCⅡ和8个B淋巴细胞表位优势表位构建的多表位疫苗MEV-IpaJ。多表位疫苗MEV-IpaJ的分子质量为28.18 ku,为稳定亲水蛋白,具有良好的抗原性,存在4个潜在的N-糖基化位点,α-螺旋、延长链、β-转角和无规则卷曲分别占20.38%、19.23%、8.08%和52.31%。三级结构Ramachandran作图显示,优势区域中含有残基数占89.9%%,进行细化后优势区域的残基数增加到94.0%,三级结构突出表位作图也证明MEV-IpaJ具有良好的免疫原性。分子对接结果显示,MEV-IpaJ与Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)和TLR4蛋白分子可对接。免疫模拟结果显示,MEV-IpaJ具有较好的免疫应答,能提高部分细胞因子的表达,经密码子优化确保设计的MEV-IpaJ可在大肠杆菌K12表达系统中高效、稳定地表达。【结论】本研究构建的多表位疫苗MEV-IpaJ可有效表达并可能诱导强烈的T细胞和B细胞免疫应答。本研究为雏沙门菌多表位疫苗的设计提供了一种新的方法,为雏沙门菌多表位疫苗的研发提供了理论依据及数据支持。

表达NDV HN蛋白的减毒雏沙门菌ΔcrpC79-13(pcDNA3.0-HN)的构建及生物学特性研究

为了构建表达鸡新城疫病毒(N D V)血凝素-神经氨酸酶(H N)蛋白的重组减毒雏沙门菌,以p M D18-HN为模板,经PCR扩增出HN基因后定向插入真核表达载体pc DNA3.0中,构建重组质粒pc DNA-3.0-HN,再通过电转化的方法将重组质粒转入雏沙门菌Δcrp C79-13中,构建重组减毒雏沙门菌Δcrp C79-13(pc DNA3.0-HN),并进一步研究其生物学特性及侵染Vero细胞后HN蛋白在细胞内的表达情况。PCR和酶切结果显示,重组菌Δcrp C79-13(pc DNA3.0-HN)构建成功;生物学特性结果显示,重组菌失去了利用麦芽糖、丙三醇和山梨醇及分解H2S等的能力,生长速度显著地低于野生株C79-13,且可稳定遗传HN基因;间接免疫荧光试验结果显示,在重组菌侵染Vero细胞后第48小时可检测到HN蛋白特异性荧光。雏鸡口服攻毒试验结果表明,重组菌Δcrp C79-13(pc DNA3.0-HN)的半数致死量约为野生株C79-13的421.6×106倍。以上结果表明,本研究成功构建了能瞬时表达NDV HN蛋白的口服重组减毒雏沙门菌,为进一步将其开发为新型鸡白痢-新城疫基因工程口服活疫苗奠定了基础。

雏沙门菌S06004株毒力岛1缺失株的构建及其基本生物学特性的测定

为了解毒力岛1(SPI1)对雏沙门菌致病性的影响,初步探索研制安全有效的雏沙门菌减毒株,采用λ-red同源重组系统成功构建了雏沙门菌S06004株的SPI1(约40kb)缺失株S06004ΔSPI1。进一步的生物学特性研究显示,SPI1的缺失不影响雏沙门菌的生化特性和生长特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,它对3日龄雏鸡的LD50是野生株的21倍。结果表明,SPI1的缺失则引起雏沙门菌毒力明显下降,这为进一步研究雏沙门菌SPI1的功能及制备减毒活疫苗奠定了一定的基础。