雷公藤内酯醇生物涂膜的质量标准研究(Ⅰ)

目的建立雷公藤内酯醇生物涂膜的质量标准,雷公藤内酯醇生物涂膜中雷公藤内酯醇的含量测定。方法雷公藤内酯醇生物涂膜经甲醇超声提取。色谱柱：Agilent2DRBAX SB-C18色谱柱（250×4.0mm,5μm）。流动相为乙腈∶水（3∶7）.检测波长：220nm。结果雷公藤内酯醇线形范围均在5~120μg·mL-1,浓度线性关系良好。（r=0.9985）。平均回收率97.3%（n=9）。RSD〈3%。结论本方法重现性好,灵敏度高。

雷公藤内酯醇及其衍生物的神经保护作用及机制

雷公藤是我国的传统中药,雷公藤内酯醇是雷公藤提取物中具有抗炎和免疫调节活性功能的主要成分。近年来,大量证据表明,雷公藤内酯醇及其衍生物(雷公藤氯内酯醇和5-羟雷公藤内酯醇)对帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化等神经变性疾病具有明确的神经保护作用。现代药理学研究表明,雷公藤内酯醇及其衍生物的神经保护作用机制与其抑制小胶质细胞活化及炎性反应因子释放、抑制氧化应激、拮抗兴奋性氨基酸毒性、抑制钙超载以及促进神经营养因子的合成有关。进一步的研究表明,雷公藤内酯醇及其衍生物主要通过影响MAPKs和NF-κB信号转导通路发挥神经保护作用。

雷公藤内酯醇抑制小鼠肾小球系膜细胞表达CXCL10的实验研究

目的探讨雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)对γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)诱导的小鼠肾小球系膜细胞(SV40MES13)表达趋化因子CXCL10 m RNA的影响及其可能机制。方法将对数生长期SV40MES13随机分为空白组、刺激组、干预组,用不同浓度的IFN-γ(0U/ml^2000U/ml)刺激细胞不同时间(0h^48h)后,观察细胞表达CXCL10 m RNA的变化;用CCK-8法检测不同浓度(2ng/ml^20ng/ml)TPL对SV40MES13生存率的影响,选用细胞生存率大于90%的TPL用于后续实验,观察TPL对SV40MES13表达CXCL10 m RNA的影响;选用JAK/STAT信号通路特异性抑制剂AG490干预细胞,探讨IFN-γ是否通过JAK/STAT信号通路诱导CXCL10表达;收集以上细胞,用Real-Time PCR技术检测各组CXCL10 m RNA表达水平。结果 IFN-γ能诱导SV40MES13表达CXCL10 m RNA,并呈时间、剂量依赖性;AG490具有抑制IFN-γ诱导的SV40MES13表达CXCL10 m RNA;TPL具有抑制IFN-γ诱导的SV40MES13表达CXCL10 m RNA的作用。结论 IFN-γ可能通过激活JAK/STAT信号通路,诱导SV40MES13表达CXCL10 m RNA;TPL具有抑制IFN-γ诱导的SV40MES13表达CXCL10的作用。

雷公藤内酯醇对AngⅡ介导的肾小球系膜细胞核因子-κB活化及MCP-1表达的影响

目的:观察不同剂量雷公藤内酯醇对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导的肾小球系膜细胞(GMC)核因子-κB(NF-κB)活化及单核细胞趋化因子-1(MCP-1)表达的影响,探讨雷公藤内酯醇抑制肾小球系膜细胞炎症因子表达的可能机制。方法:分离培养大鼠GMC,用10-6mol/LAngⅡ刺激GMC,将培养的大鼠GMC随机分为5组:正常培养对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ和3种不同浓度的雷公藤内酯醇共孵育组。分别采用酶联免疫激光扫描共聚焦显微镜、ELISA、RT-PCR法、WesternBlot法,检测GMC内NF-κBp65核易位阳性率、细胞培养上清液中MCP-1水平、GMC内MCP-1mRNA表达及ⅠκBα蛋白表达水平。结果:雷公藤内酯醇呈剂量依赖性下调AngⅡ介导的大鼠GMC内NF-κBp65水平,抑制AngⅡ诱导的大鼠GMCMCP-1及MCP-1mRNA的表达,抑制AngⅡ诱导的大鼠GMC内ⅠκBα蛋白表达下调。结论:雷公藤内酯醇能够抑制AngⅡ诱导的大鼠GMCⅠκB的磷酸化降解及NF-κB活化;抑制AngⅡ诱导的大鼠GMCMCP-1mRNA表达MCP-1分泌。

雷公藤内酯醇对试验性色素膜视网膜炎Th_1反应相关因子的抑制作用

目的:探讨雷公藤内酯醇（TP）对试验性色素膜视网膜炎（EAU）Th1反应相关因子的抑制作用。方法:用ELISA检测IL-12、IFN-γ水平;采用原位杂交染色法,观测TP对EAU的T淋巴细胞IL-12mRNA的表达的影响;采用电泳迁移率改变试验对EAU T淋巴细胞NF-AT活性检测。结果:①TP能有效的降低S-抗原诱导产生的EAU（P<0.05）;②TP能降低EAU T淋巴细胞IL-12、IFN-γ分泌水平;③P能抑制EAT淋巴细胞IL-12 mRNA的表达;④TP抑制EAU T淋巴细胞NF-AT活性。结论:TP对EAU的免疫抑制作用可能是通过抑制与Th1反应相关的调节因子使Th1反应减弱,而使EAU的发病率明显降低。

抗肿瘤雷公藤内酯醇半合成衍生物理化性质及其有关物质的研究

目的研究雷公藤内酯醇半合成衍生物（MC002）的理化性质和有关物质,为剂型设计提供依据。方法采用紫外分光光度法测定MC002在甲醇中的吸收系数;采用红外光谱仪测定MC002的红外吸收光谱;按中国药典2010版二部中溶解度的测定方法测定在不同溶剂中的近似溶解度;采用摇瓶法测定MC002在正辛醇-水、正辛醇-pH=7.4磷酸盐缓冲液中的油水分配系数;用Thiele管测定熔点;采用X-射线粉末衍射法测定其晶型。结果 MC002在甲醇中的吸收系数（E1%）为226.23±29.18;样品红外吸收光谱图与标准品谱图基本一致,易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮,微溶于氯仿和乙酸乙酯,在乙醚中极微溶解;在正辛醇-水和正辛醇-pH=7.4磷酸盐缓冲液中的分配系数分别为0.074 0和1.080;熔点为50∽52℃;X-射线粉末衍射说明MC002为非结晶型粉末。3批有关物质测定均〈1%,样品纯度〉99%。结论 MC002是一个亲水性很强的盐类药物,本实验确定的MC002部分理化性质和有关物质分析,可为其生物药剂学的研究及剂型设计提供依据。

雷公藤内酯醇对试验性色素膜视网膜炎IL-12 mRNA表达以及NF-AT活性的抑制作用

目的 :探讨雷公藤内酯醇对试验性色素膜视网膜炎IL 12mRNA表达的影响及其机制。方法 :采用原位杂交染色法和电泳迁移率改变试验观测雷公藤内酯醇对试验性色素膜视网膜炎的T淋巴细胞IL 12mRNA的表达及NF AT活性。结果 :雷公藤内酯醇能有效地降低S 抗原诱导产生的试验性色素膜视网膜炎 ,能抑制淋巴细胞IL 12mRNA的表达及NF AT活性。结论 :雷公藤内酯醇对EAU的免疫抑制作用可能是通过抑制与Th1反应相关的调节因子使Th1反应减弱 。

肉桂酰雷公藤内酯醇通过抑制核因子κB (NF-κB)通路下调小鼠肾小球系膜细胞IP-10表达并抑制其增殖

目的 探讨肉桂酰雷公藤内酯醇(T32)对γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)在SV40MES13小鼠肾小球系膜细胞表达及促增殖作用的影响。方法 采用(2~30)ng/mL T32和(1~500)ng/mL IP-10与SV40MES13细胞共培养24 h,利用CCK-8法检测细胞生存率确定T32和IP-10最佳处理剂量;将对数生长期的SV40MES13细胞随机分为空白组、 1000 U/mLγ干扰素(IFN-γ)刺激组、 IFN-γ联合10μmol/L吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干预组和IFN-γ联合(2~20)ng/mL T32干预组。IFN-γ刺激24 h后,通过实时荧光定量PCR检测SV40MES13细胞IP-10 mRNA水平,ELISA检测SV40MES13细胞培养上清液IP-10分泌量;IFN-γ刺激20 min后,应用Western blot法检测SV40MES13细胞核因子κB (NF-κB)信号通路相关蛋白核因子κB p65(NF-κB p65)、核因子κB抑制物α(IκBα)及其磷酸化蛋白p-NF-κB p65、 p-IκBα的表达。结果 IFN-γ刺激可促进SV40MES13细胞IP-10 mRNA和蛋白表达增加,与空白组相比,NF-κB p65、 IκBα蛋白的磷酸化水平明显增加。采用特异性通路抑制剂PDTC阻断NF-κB信号通路后,与IFN-γ刺激组相比,SV40MES13细胞IP-10 mRNA和蛋白表达明显降低,NF-κB p65、 IκBα蛋白磷酸化水平下降。与IFN-γ刺激组相比,经(2~20)ng/mL T32干预后,SV40MES13细胞IP-10 mRNA和蛋白表达明显降低,NF-κB p65、 IκBα蛋白磷酸化水平分别下降44.22%和48.59%。(1~500)ng/mL IP-10与SV40MES13细胞共同孵育24 h后,细胞生存率提高,IP-10剂量为10 ng/mL时细胞生存率为119.83%,随后进入平台期;经(4~20)ng/mL T32干预后,细胞生存率与10 ng/mL IP-10刺激组相比明显降低。结论 IFN-γ诱导SV40MES13细胞表达IP-10的作用可被肉桂酰雷公藤内酯醇通过阻断NF-κB信号通路而下调,并抑制IP-10的促增殖作用。

雷公藤内酯醇抑制小鼠肾小球系膜细胞表达IP-10及其机制研究

目的探讨雷公藤内酯醇(TPL)对γ干扰素(IFN-γ)诱导的小鼠肾小球系膜细胞(MMC)表达γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)的影响及其调控机制,为TPL应用于狼疮肾炎的治疗奠定理论基础、提供实验数据。方法将MMC随机分为空白组、IFN-γ刺激组、TPL干预组,用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测各组中IP-10 m RNA相对表达量;用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞培养上清液中IP-10分泌量;用蛋白印迹法(Western blot)检测各组中JAK/STAT1信号通路相关蛋白JAK1、JAK2、STAT1及其磷酸化蛋白p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1,以及IFN-γ受体(IFN-γRβ)和JAK/STAT1信号通路负反馈调节蛋白SOCS1的表达情况。结果 1)MMC经不同质量浓度(2、4、8、10 ng/ml)TPL预处理2 h后再加入IFN-γ共同作用24 h,IP-10 m RNA相对表达量与刺激组相比分别下降45.35%、65.40%、89.76%和94.72%(P均<0.01);IP-10蛋白分泌量分别下降了5.21%(P=0.531)、54.70%(P<0.01)、87.17%(P<0.01)和92.45%(P<0.01)。2)MMC经TPL预处理40 min后再加入IFN-γ共同作用20 min,JAK1、JAK2、STAT1蛋白磷酸化水平与刺激组相比明显降低(PJAK1<0.01、PJAK2<0.01和PSTAT1<0.05)。3)MMC经IFN-γ刺激后,IFN-γRβ蛋白表达水平与空白组相比明显增加(P<0.01);经TPL干预后,IFN-γRβ蛋白表达水平与刺激组相比明显减少(P<0.01)。4)IFN-γ刺激MMC后,SOCS1蛋白表达水平与空白组相比小幅升高(P<0.05);而经TPL刺激后,SOCS1蛋白表达与刺激组相比明显增加(P<0.01)。结论 TPL可能通过抑制JAK/STAT1信号通路,从而下调IFN-γ诱导的MMC表达IP-10;抑制IP-10表达,减轻或阻止炎症反应,有望成为TPL治疗狼疮肾炎的新靶点。

雷公藤内酯醇对糖尿病肾内高压牵张系膜细胞模型细胞因子表达的抑制

人肾系膜细胞经牵张12h后所表达的VEGF和TGF-β1分别升高1.5和1.7倍的病态,在应用雷公藤内酯醇处理后明显减轻。

雷公藤内酯醇在Beagle犬体内的药代动力学

雷公藤内酯醇（triptolide，TP）是雷公藤的主要有效成分之一。研究不同剂量TP在Beagle犬灌胃给药时的绝对生物利用度和药代动力学，可望为其临床研究提供参考。以泼尼松龙作内标，用乙酸乙酯液液萃取，建立LC—APCI／MS选择性离子监测方法测定血浆TP浓度。Beagle犬分别静脉注射TP0．05mg·kg^-1、灌胃TP0．05，0．08和0．1mg·kg^-1。进行药代动力学和绝对生物利用度研究。结果表明，TP在1—200ng·mL^-1呈良好线性关系（r=0．9997），批内和批间精密度RSD均小于10％，准确度在95．0％～105．0％，提取回收率大于75％。静注0．05mg·kg^-1 TP后，T1/2β为（2．5±0．8）h。3个剂量灌胃组，Tmax,T1/2α和T1/2β,经检验无统计学差异。AUC和Cmax与剂量之间线性相关。灌胃0．05mg·kg^-1后，TP在Beagle犬体内绝对生物利用度为（75±17）％。可见，LC—APCI／MS法灵敏、可靠、专属性强，可用来测定Beagle犬血浆TP的浓度；TP在Beagle犬体内消除较快，灌胃给药生物利用度较高。

雷公藤内酯醇衍生物对肝癌细胞增殖、凋亡的作用研究

目的研究新型雷公藤内酯醇(Triptolide,TPL)衍生物对正常肝细胞的毒性以及对肝癌细胞的增殖、凋亡作用。方法通过对TPL进行化学修饰,获得2种新型衍生物:雷公藤内酯三醇(TP-3-OH)和丙烯酸雷公藤甲素酯(TPO)。通过体外培养人胚胎肝细胞LO2和肝癌细胞Hep G2、Hep3B、SMMC-7721,分为DMSO对照组,TPL/TP-3-OH/TPO低、中、高浓度组(25、50、100 nmol·L^(-1))。通过检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的活性来评价TP-3-OH、TPO对肝细胞的毒性;采用MTT实验检测细胞增殖情况;采用流式细胞术及Western Blot法检测细胞凋亡及凋亡通路相关蛋白表达情况;采用划痕实验检测细胞迁移能力。结果与TPL组比较,50、100 nmol·L^(-1)浓度条件下TP-3-OH、TPO组的LO2细胞培养上清中的LDH活性明显降低(P<0.05,P<0.01)。与DMSO对照组比较,TPO中、高浓度(50、100 nmol·L^(-1))组的LO2细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05,P<0.01),TPO低、中、高浓度(25、50、100 nmol·L^(-1))组的Hep G2、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞增殖抑制率均明显升高(P<0.05,P<0.01);TPO高浓度(100 nmol·L^(-1))组的LO2、Hep G2和SMMC-7721细胞的早期、晚期细胞凋亡率均明显升高(P<0.05,P<0.01);TPO中、高浓度(50、100 nmol·L^(-1))组SMMC-7721、Hep G2细胞的cleaved-Caspase-3、cleaved-PARP蛋白表达显著上调(P<0.01);TPO中浓度(50 nmol·L^(-1))组SMMC-7721细胞的24 h迁移率明显降低(P<0.05)。结论经化学修饰获得的2种新型TPL衍生物对肝细胞的毒性降低,其中TPO具有抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡的作用。

雷公藤内酯醇对AngⅡ介导的大鼠GMC增殖的影响

目的:观察不同剂量雷公藤内酯醇对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导的肾小球系膜细胞增殖的影响,探讨其可能机制。方法:分离培养大鼠GMC,用10-6mol/LAngⅡ刺激GMC,将培养的大鼠GMC随机分为5组:正常培养对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ和3种不同浓度(15、10、5μg/L)的雷公藤内酯醇共孵育组。分别采用MIT法及流式细胞术检测大鼠GMC增殖及细胞周期的变化。结果:雷公藤内酯醇能抑制AngⅡ介导的大鼠GMC增殖,降低S+G2/M期细胞比例,其中以高浓度雷公藤内酯醇作用最强(P<0.01)。结论:雷公藤内酯醇可能通过减少DNA合成期(S期)细胞数量,抑制大鼠GMC增殖。

雷公藤内酯醇对K562细胞热休克蛋白70表达及拓扑异构酶活性的影响

目的:研究雷公藤内酯醇(TPL)对K562细胞热休克蛋白70(HSP70)表达、溶酶体膜透化作用(lysosomal membrane permeabilization,LMP)以及对DNA拓扑异构酶(TOPO)、III的影响。方法:应用MTT法检测TPL对K562细胞增殖的影响;Western blot法检测TPL对K562细胞热休克蛋白70的影响;用丫啶橙重新定位法检测TPL对LMP的影响;通过电泳法测定TPL对K562细胞DNA拓扑异构酶I、II活性的影响。结果:TPL对HSP70蛋白表达有抑制作用;TPL能明显诱导K562细胞LMP的发生;TPL不能抑制TOPO I的活性,400μg/ml的TPL开始抑制K562细胞TOPO II的活性。结论:TPL可能通过下调HSP70蛋白的表达,使HSP70失去了抑制LMP的功能,导致了LMP的发生;DNA拓扑异构酶不是TPL抑制K562细胞增殖的靶点。

TNFα诱导人肾小管细胞C3产物上调及雷公藤内酯醇对其作用的影响

近年来,随着分子生物学技术的发展研究发现,除肝脏和巨噬细胞是补体合成的主要来源外,肾脏固有细胞也能表达各种补体成分.并且,随着肾脏病变程度的加重,肾局部补体(特别是C3、C4)mRNA表达和蛋白合成也显著增加,其中以肾小管细胞表现的最为明显,提示肾小管细胞具有免疫炎性活性.肾脏移植免疫技术的应用也发现,移植肾肾功能的下降和排异反应的发生与供肾局部,尤其是肾小管细胞C3的过度产生密切相关.因此,肾局部特别是肾小管细胞在致病因素(如致炎细胞因子)诱导下过度生成并激活的补体在肾损伤中的重要作用已受到了重视,由此补体抑制剂的产生和应用也越来越引起关注.

HPLC法测定雷公藤内酯醇生物贴中雷公藤内酯醇

目的建立雷公藤内酯醇生物贴的质量标准,雷公藤内酯醇生物贴中雷公藤内酯醇的定量测定方法。方法雷公藤内酯醇生物贴经甲醇超声提取。色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为乙腈-水（3∶7）,检测波长为220 nm。结果雷公藤内酯醇在5-120μg/mL,线性关系良好（r=0.9981）。平均回收率96.5%（n=9）。RSD〈3%。结论本方法重现性好,灵敏度高。

雷公藤内酯醇半合成衍生物对人结肠癌细胞系荷瘤小鼠肿瘤抑制作用的研究

目的:观察和评价雷公藤内酯醇的半合成衍生物(MC002)对人结肠癌HCT-8小鼠模型的肿瘤抑制作用。方法:用BALB/C裸小鼠接种人结肠癌HCT-8瘤株造成小鼠肿瘤模型,以MC002对荷瘤小鼠的相对肿瘤增殖率、瘤重、抑瘤率为指标评价MC002对小鼠的抑瘤作用。结果:MC002各剂量组瘤体积明显小于模型对照组,瘤重均显著降低,在1.5 mg.kg-1、1.0 mg.kg-1给药10次后T/C%均小于40%(P<0.05),且具有量效关系。结论:MC002能有效抑制人结肠癌HCT-8荷瘤小鼠体内肿瘤生长。通过深入研究MC002有可能发展成为一种新型抗癌药。

雷公藤内酯醇抑制COX-2表达调控胰腺癌细胞生物学性状的实验研究

雷公藤内酯醇（triptolide,TPL）是从中国传统中药雷公藤中提取的有效成分.近年来的研究发现,TPL不仅具有抗炎、抗免疫反应等多种药理作用,还具有广谱抗肿瘤作用,是一种多靶点的天然抗肿瘤药物[1-4].实验表明,TPL能抑制体外培养的胰腺癌细胞增殖及胰腺癌动物移植瘤的生长[1].环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）为一种诱导型酶,与多种肿瘤的发生、发展密切相关[5].研究发现,TPL不仅可通过抑制COX-2表达调控炎症过程,还可通过下调COX-2表达抑制结肠癌细胞的增殖和迁移[2,6].然而TPL是否也通过下调胰腺癌细胞COX-2的表达而抑制肿瘤生长目前尚不清楚.本研究应用TPL干预人胰腺癌PANC1细胞,观察其对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用,探讨其相关机制。

雷公藤内酯醇生物贴的体外透皮吸收研究

目的研究雷公藤内酯醇生物贴的体外经皮吸收特点。方法利用改良Franz扩散池研究雷公藤内酯醇生物贴的经皮吸收特点,以HPLC法测定雷公藤内酯醇的经皮吸收量。结果雷公藤内酯醇生物贴中的雷公藤内酯醇在24h内以一级动力学经皮渗透,累积渗透量为2.0573μg/cm2。结论雷公藤内酯醇生物贴中雷公藤内酯醇的体外透皮吸收效果优于文献报道的巴布剂。