比较蛋白质组学揭示茉莉酸甲酯诱导的雷公藤甲素生物合成

目的:探索雷公藤甲素生物合成途径,以提高其产量或用于合成生物学异源生产。方法:使用无标记(lable-free)比较蛋白质组学对茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的雷公藤悬浮细胞进行测序,通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)、基因本体(GO)分析等方法,结合基因转录表达分析和基因体内功能研究,逐步筛选参与雷公藤甲素生物合成的功能基因。结果:MeJA诱导不同时间的样品组鉴定得到376个差异蛋白质,包括8个细胞色素P450酶(CYP450)、3个转录因子(TF)和2-氧戊二酸依赖的双加氧酶(2ODD)。其中CYP71BE89、CYP82AQ2和Tw2ODD基因在MeJA诱导及植物不同组织部位中,均与已知参与雷公藤甲素母核环化的二萜合酶TwTPS7(v2)和TwTPS27(v2)基因具有相似的表达模式,表明其可能与雷公藤甲素生物合成相关。进一步利用植物细胞体内功能研究,验证了CYP71BE89、CYP82AQ2和Tw2ODD基因干扰使雷公藤甲素积累分别降低了24.1%、41.4%和71.4%,表明了3个基因与雷公藤甲素生物合成直接相关。结论:利用比较蛋白质组学技术揭示了几种与雷公藤甲素生物合成相关的蛋白,进一步表征了雷公藤甲素生物合成与外源激素刺激之间的关系,并为发掘中药活性成分生物合成途径提供了一种有效方法。

雷公藤甲素对大鼠卵巢氧化应激及颗粒细胞线粒体自噬的影响

目的观察雷公藤甲素(TP)不同浓度和作用时间对大鼠卵巢氧化应激及颗粒细胞线粒体自噬的影响。方法取3个月龄雌性Sprague-Dawley大鼠50只,连续观察2个动情周期,筛选出25只动情周期正常的大鼠,按随机数字表法分为空白对照组、实验1组、实验2组、实验3组和实验4组,每组5只。实验1组大鼠每日给予400μg·kg^(-1)的TP灌胃1次,连续灌胃30 d;实验2组大鼠每日给予400μg·kg^(-1)的TP灌胃1次,连续灌胃40 d;实验3组大鼠每日给予500μg·kg^(-1)的TP灌胃1次,连续灌胃30 d;实验4组大鼠每日给予500μg·kg^(-1)的TP灌胃1次,连续灌胃40 d;空白对照组大鼠每日给予10 mL·kg^(-1)蒸馏水灌胃1次,连续灌胃40 d。应用酶联免疫吸附测定法检测各组大鼠血清抗苗勒管激素(AMH)、雌二醇(E_(2))、促卵泡生成素(FSH)水平,苏木精-伊红染色观察各组大鼠卵巢组织病理变化,使用酶标仪检测各组大鼠卵巢组织中丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性,透射电子显微镜观察各组大鼠卵巢颗粒细胞线粒体形态结构变化及线粒体自噬情况,流式细胞仪检测各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率。结果与空白对照组比较,实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠血清中AMH、E_(2)水平及卵巢组织中SOD活性显著降低,血清中FSH及卵巢组织中MDA水平显著增高(P<0.05)。与实验1组比较,实验2组、实验3组、实验4组大鼠血清中AMH、E_(2)水平及卵巢组织SOD活性显著降低,血清中FSH及卵巢组织中MDA水平显著增高(P<0.05)。实验2组、实验3组、实验4组大鼠血清中AMH、E_(2)、FSH水平及卵巢组织中SOD活性、MDA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率均显著高于空白对照组(P<0.05);实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于实验1组(P<0.05);实验3组、实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于实验2组(P<0.05);实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于实验3组(P<0.05)。空白对照组大鼠卵巢组织被膜完整,皮质区原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡等数量较为正常,各级卵泡发育正常,闭锁卵泡少见,黄体数量较少;髓质区纤维结缔组织排列紧密,未见明显水肿或坏死。实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢组织可见卵泡数量减少,闭锁卵泡增多,颗粒层卵泡细胞坏死、脱落和卵泡囊性扩张等病理改变;实验1组大鼠卵巢组织病理改变程度相对较轻,闭锁卵泡少,颗粒层细胞坏死不多;实验4组大鼠卵巢组织病变程度相对最重,可见较多闭锁卵泡和颗粒细胞层坏死、脱落;实验2组和实验3组大鼠卵巢组织病变程度相对轻于实验4组,闭锁卵泡较少,颗粒细胞层不同程度坏死和卵泡囊性扩张。空白对照组大鼠的卵巢颗粒细胞形态结构正常,其细胞核呈不规则多边形,染色质分布均匀,以常染色质为主,核膜清晰完整,细胞质中可见线粒体等细胞器且结构完整清晰。实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢颗粒细胞的细胞质中可见不同程度的线粒体自噬,实验2组、实验3组、实验4组大鼠线粒体自噬程度重于实验1组,实验3组、实验4组大鼠线粒体自噬程度重于实验2组,实验3组与实验4组自噬程度相当;实验3组和实验4组电镜下见卵巢颗粒细胞的细胞质中含较多线粒体自噬小体,多数线粒体发生轻度肿胀,部分线粒体嵴结构消失,粗面内质网扩张呈囊状。结论采用TP灌胃给药可成功构建大鼠卵巢功能减退模型,大鼠卵巢损伤与TP剂量和干预时间有关;TP诱导的卵巢氧化应激损伤可能是引发卵巢功能低下的重要因素,其作用机制可能是氧化应激影响卵巢内分泌功能和诱导颗粒细胞凋亡等病理生理过程。随着氧化应激损伤加重,线粒体自噬增加,线粒体自噬到达一定程度后不再随着TP的干预时间继续增加而持续增强。

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨雷公藤甲素联合脉冲射频对大鼠神经性疼痛模型抗炎镇痛的作用机制

目的 探讨雷公藤甲素联合脉冲射频对大鼠神经性疼痛模型的抗炎镇痛作用及相关机制。方法 将SD大鼠随机分为假手术组、脊神经结扎组、雷公藤甲素组、脉冲射频组、雷公藤甲素联合脉冲射频组。构建脊神经结扎模型大鼠,检测大鼠疼痛行为学变化;蛋白质印迹法检测坐骨神经组织中Wnt-3α、β-catenin、frizzled7蛋白表达;聚合酶链式反应检测坐骨神经组织中Il-1β、Cox-2、Tnf-α、p65 Nf-κB mRNA表达;免疫组织化学检测坐骨神经组织中SP和C-fos蛋白表达。结果 除假手术组外,其余各组机械性缩足反射阈值在术后第1天急剧下降,术后第5天脊神经结扎组的机械性缩足反射阈值趋于稳定,各治疗组的机械性缩足反射阈值逐渐上升。除假手术组外,其余各组热缩足反射潜伏期在术后前3天急剧下降,术后第3天各组热缩足反射潜伏期开始升高,各治疗组的升高速度均高于脊神经结扎组。蛋白质印迹法结果显示术后第3、7、14天,脊神经结扎组Wnt-3α、β-catenin、frizzled7蛋白表达升高。与脊神经结扎组比,术后第3天各治疗组Wnt-3α、β-catenin、frizzled7蛋白表达差异较小,术后第7天和第14天各治疗组蛋白表达均降低,且雷公藤甲素联合脉冲射频组的相对表达量最低。聚合酶链式反应结果显示术后第3、7、14天,与假手术组比,脊神经结扎组的Il-1β、Cox-2、Tnf-α、p65 Nf-κB mRNA表达升高。与脊神经结扎组比,术后第7天和第14天各治疗组的mRNA表达均降低,且雷公藤甲素联合脉冲射频组表达最低。免疫组织化学结果显示脊神经结扎组中SP和C-fos蛋白表达高于假手术组,且随着时间的延长两种蛋白表达逐渐升高。与脊神经结扎组比,各治疗组SP、C-fos蛋白表达水平随治疗时间的延长均降低,且雷公藤甲素联合脉冲射频组降低最明显。结论 雷公藤甲素联合脉冲射频治疗通过调控Wnt/β-catenin信号通路减轻大鼠神经性疼痛模型炎症和疼痛反应。

雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响

目的 探讨雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β(AKT/GSK-3β)通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响。方法 体外培养MGC803细胞,确定雷公藤甲素的干预剂量和干预时间。将细胞分为阴性对照组(A组,不进行处理),阳性对照组(B组,10μmol/L顺铂),雷公藤甲素高、中、低剂量组(C组、D组、E组)。干预48 h,采用Transwell法检测细胞侵袭能力,采用划痕试验法检测迁移能力,采用免疫印迹(Western blot)法检测检测相关蛋白的表达。结果 随着雷公藤甲素浓度的增加,MGC803细胞增殖率降低(P <0.05);48 h时半数抑制浓度(IC50)最小,选择干预时间为48 h,C组、D组、E组的干预剂量分别为80,40,20 nmol/L。与B组比较,C组、D组、E组侵袭细胞数、细胞迁移距离及波形蛋白(vimentin),snail,p-AKT/AKT,p-GSK-3β/GSK-3β表达水平均显著升高(P <0.05),上皮钙黏素(E-cadherin)、β-联蛋白(β-catenin)表达水平均显著降低(P <0.05),且呈剂量依赖关系。结论 雷公藤甲素可通过抑制AKT/GSK-3β信号通路而抑制MGC803细胞增殖、侵袭与迁移。

雷公藤甲素通过抑制细胞铁死亡减轻博来霉素诱发的小鼠肺纤维化

目的:探讨雷公藤甲素(TPL)对博来霉素(BLM)诱导肺纤维化小鼠的改善效果,揭示铁死亡参与TPL改善肺纤维化的潜在机制。方法:选择SPF级小鼠,随机分为3组:对照组、模型组(BLM处理组)和实验组(BLM+TPL处理组),每组10只。Day 0,模型组和实验组小鼠气管灌注BLM水溶液(50μL,5 mg/kg),对照组小鼠接受等体积的生理盐水。Day 1起,实验组小鼠开始灌胃TPL悬液(200μL,0.25 mg/kg),每3 d一次,共7次,对照组和模型组分别接受等体积生理盐水。Masson染色检测肺组织纤维化,TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡;体外CCK8法检测细胞活力,流式细胞术及活死染色检测细胞凋亡,免疫荧光法检测细胞脂质过氧化,Western blot检测肺组织及细胞中目的蛋白表达。结果:TPL处理通过下调肺组织中Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达(P<0.05),显著降低BLM诱导小鼠肺部纤维化程度(P<0.01);同时,TPL处理可显著上调肺组织中谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)和铁死亡抑制蛋白1(FSP1)表达(P<0.05),下调转铁蛋白受体1(TfR1)表达(P<0.05),从而抑制BLM诱导的肺部细胞铁死亡和凋亡(P<0.01)。体外研究结果表明,TPL处理可显著抑制肺上皮细胞凋亡(P<0.01),进一步检测发现TPL处理可显著降低BLM诱导的肺泡上皮细胞内脂质过氧化(P<0.01),显著上调细胞内GPX4和FSP1蛋白表达(P<0.01),下调TfR1蛋白表达(P<0.05),通过抑制细胞铁死亡来显著降低BLM诱导的肺上皮细胞凋亡率。结论:TPL可在体内外通过抑制BLM诱导的细胞铁死亡,改善肺部细胞活力,降低细胞凋亡率,从而减轻肺小鼠纤维化程度。本研究为临床使用TPL治疗肺间质病变提供理论依据。

雷公藤甲素双向调控Nrf2/p65产生毒/效作用的机制研究

目的探索雷公藤甲素(TP)双向调控Nrf2/p65产生毒性与保护的双重作用及机制。方法通过小分子与蛋白质对接模拟,分析TP与Nrf2/p65的潜在作用关系。在细胞实验里,采用不同浓度的TP分别干预人正常肝脏细胞(L02)与小鼠肝库普弗细胞(KC),采用MTT法检测细胞存活率,Western blot检测Nrf2、HO1、p65、IL-6的蛋白表达;在动物实验里,采用TP干预糖尿病肾病(DN)模型大鼠,HE染色法检测大鼠肾脏病理,靛酚蓝比色法检测血清BUN,ELISA法检测血清炎症因子TNF-α、IL-6与IL-1β的含量变化,RT-qPCR检测肾组织中p65、podocin和Kim-1的mRNA水平,Western blot检测肾组织中p65的蛋白表达,免疫组化法观察肾组织细胞p65与Nrf2的蛋白表达情况。结果分子对接结果表明,TP与Nrf2及p65具有良好结合活性;体外实验表明,TP可以降低L02细胞存活率,呈剂量和时间依赖性降低Nrf2蛋白表达,降低KC细胞存活率,抑制Nrf2及其下游HO-1的表达,上调p65及IL-6的表达;动物实验表明,TP对DN大鼠有明显保护作用,降低大鼠肾组织中p65的mRNA及蛋白的表达,上调Nrf2蛋白的表达,下调血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子水平。结论TP可以通过下调Nrf2蛋白表达,上调p65蛋白的表达对肝细胞造成毒性损伤;同时也可以上调Nrf2蛋白表达,下调p65蛋白与mRNA的表达而对DN大鼠产生保护作用,即对Nrf2/p65分子产生双向调控而表现毒性或药性。

雷公藤甲素通过促进小胶质细胞M2极化减轻脑缺血再灌注大鼠神经元损伤

目的研究雷公藤甲素(TP)对大鼠脑缺血再灌注(I/R)后小胶质细胞M1/M2极化的影响及分子机制。方法采用大脑中动脉栓塞法(MCAO)制备大脑中动脉栓塞再灌注模型,给予(0.1、0.2)mg/kg TP处理,假手术组大鼠作为对照。Longa评分法进行大鼠神经功能缺损进行评分,HE染色观察缺血侧脑组织神经元形态,神经元特异性核蛋白(NeuN)免疫荧光染色观察神经元数量;Western blot法检测缺血侧脑组织钙离子结合接头蛋白分子1(Iba1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg1)、Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)、NeuN和胱天蛋白酶3(caspase-3)的表达;ELISA检测白细胞介素1β(IL-1β)和IL-10的水平;免疫荧光双标记法检测小胶质细胞内Arg1和TLR4的表达。结果与模型组比较,TP处理组神经学评分明显降低,神经元损伤明显改善;IL-1β水平降低,IL-10水平增加;iNOS、TLR4、NF-κB、和caspase-3表达降低,Arg1和NeuN表达增加。结论TP处理逆转大鼠脑I/R损伤,可能与促进小胶质细胞M2极化、减少炎症因子释放与抑制凋亡有关。

网络药理学结合分子对接技术分析雷公藤甲素治疗内异症的机制

目的 选取雷公藤多苷的主要活性物质雷公藤甲素,基于网络药理学结合生物信息分析及分子对接分析雷公藤甲素治疗子宫内膜异位症(endometriosis, EMS)的潜在靶点和通路。方法 通过ChEMBL平台进行雷公藤甲素靶点收集,通过OMIM、TTD、PharmGKB数据库找出EMS的靶点;取药物靶点和疾病靶点两者的交集构建PPI网络,利用Cytoscape软件及R包筛选出核心靶点;使用string在线平台对核心靶点进行GO分析和KEGG分析。使用分子对接和生物信息分析对关键靶点进行进一步验证。结果 雷公藤甲素与EMS的共同靶点有73个,筛选出核心靶点13个,GO和KEGG富集分析发现生殖器官的发育、凋亡信号通路的调控、类固醇激素及其受体的生物功能及内分泌抵抗通路最为相关。结论 预测了雷公藤甲素治疗EMS的核心靶点、生物学过程以及关键信号通路,将有助于更好地理解雷公藤多苷在EMS治疗中的机理,为其基础研究提供一些参考。

雷公藤甲素调控nSMase2-Cer鞘脂代谢信号通路发挥抗胰腺癌的作用及其相关机制研究

目的探究雷公藤甲素抑制胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖的作用机制,揭示其抗胰腺癌的作用与神经鞘脂之间的相互联系。方法用不同浓度梯度的雷公藤甲素处理胰腺癌PANC-1细胞后,检测细胞增殖、迁移能力及凋亡情况。通过PCR array实验筛选给药后PANC-1细胞上有变化的神经鞘脂基因,并通过q-PCR和Western blot实验验证所筛选基因的转录翻译情况。构建PANC-1细胞相关基因的过表达模型并进行细胞功能性实验验证。Western blot实验检测瞬时转染的PANC-1细胞给药前后及不同药物浓度下nSMase2蛋白水平的变化及Caspase-3蛋白水平的变化。免疫荧光实验检测不同药物梯度和过表达模型下神经酰胺(Cer)含量的变化。建立BALB/C裸鼠PANC-1皮下成瘤模型,在体内验证雷公藤甲素对裸鼠肿瘤大小的影响。提取肿瘤组织进行Western blot实验,肝组织进行HE染色实验。结果雷公藤甲素呈浓度梯度抑制PANC-1细胞的增殖、迁移能力并促进细胞凋亡。神经鞘脂相关基因SMPD3与雷公藤甲素抑制PANC-1细胞活力相关性最强,且雷公藤甲素可下调其在PANC-1细胞中的表达。过表达SMPD3后PANC-1细胞增殖、迁移能力明显增强,细胞凋亡减少。雷公藤甲素可促使PANC-1细胞内Cer含量的升高,而过表达SMPD3后是可以降低PANC-1细胞内Cer的含量,此外,雷公藤甲素还能够促进PANC-1细胞Caspase家族蛋白Caspase-3表达的上调。体内实验表明雷公藤甲素能够下调SMPD3蛋白的表达,促进Caspase-3活化进而促进肿瘤发生细胞凋亡,发挥抑制裸鼠体内肿瘤生长的作用。结论体内外实验均表明雷公藤甲素通过下调SMPD3的表达,影响nSMase2-Cer信号通路抑制PANC-1细胞的生长。

雷公藤甲素诱导肺癌细胞铜死亡的机制研究

目的 探讨雷公藤甲素诱导肺癌细胞铜死亡的分子机制。方法 培养人肺癌细胞系A549和H460,采用MTT法检测细胞活力和EdU实验检测细胞增殖能力;Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;铜离子荧光探针检测细胞内铜浓度;JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位变化;Western blot检测铁硫簇蛋白FDX1、POLD1、SDHB、LIAS和脂酰化蛋白DLAT单体及寡聚体蛋白表达水平,以及铜稳态调节蛋白CTR1、ATP7A、ATP7B表达水平。结果 MTT实验显示,雷公藤甲素呈浓度依赖性抑制肺癌细胞活力,对A549和H460细胞半抑制浓度(IC50)分别为74.67nmol/L和34.12nmol/L;Ed U实验和Transwell迁移实验证实,雷公藤甲素可显著抑制肺癌细胞增殖与迁移能力(P <0.05);在雷公藤甲素处理后,在荧光显微镜下观察到A549和H460细胞内铜浓度上升,线粒体膜电位下降。进一步通过Western blot实验发现,A549和H460细胞铁硫簇蛋白FDX1、POLD1、SDHB、LIAS和脂酰化蛋白DLAT单体表达下调,DLAT寡聚体表达增加(P<0.05)。铜稳态调节蛋白CTR1表达无明显变化,ATP7A和ATP7B表达下调(P <0.05)。结论 雷公藤甲素通过下调ATP7A和ATP7B表达,使细胞内铜浓度增加,进而下调铁硫簇蛋白表达水平、增加DLAT寡聚体表达水平,诱导肺癌细胞铜死亡,抑制肺癌细胞增殖与迁移。

LC-MS/MS法测定大鼠血浆中雷公藤甲素浓度及其药代动力学研究

目的 建立一种快速可靠的测定SD大鼠血浆中雷公藤甲素(TP)浓度的高效液相色谱—串联质谱检测方法,并进行药代动力学研究。方法 以泼尼松龙为内标,采用Waters XBrige C_(18) column色谱柱、正离子模式电喷雾离子源的HPLC-MS作为多重反应监测模式进行检测。SD大鼠灌胃给予TP后,于不同时间点采集大鼠血液,进行TP的含量测定,同时考察该方法的标准曲线及定量下限、精密度和准确度、回收率与稳定性等。结果 TP在0.25~50μg/L内线性关系良好,定量下限为0.25μg/L。TP在大鼠体内的药代动力学参数T_(max)为2 h,C_(max)为0.437μg/L,t_(1/2)为1.341 h,AUC_(0~∞)为1.57μg·L^(-1)·h^(-1),MRT_(0~∞)为2.85 h。诱导剂组和抑制剂组主要动力学参数T_(max)、t_(1/2)、AUC分别是:1.33 h、2.25 h、1.271μg·L^(-1)·h^(-1)和1.33 h、1.463 h、1.188μg·L^(-1)·h^(-1)。日内、日间精密度和准确度、稳定性RSD均<5%,方法学考察均符合生物样品分析的要求。结论 该方法快速灵敏、准确可靠,适用于大鼠体内TP的血药浓度测定,为雷公藤多苷的临床安全用药提供理论依据。

雷公藤甲素对大鼠卵巢和人卵巢颗粒细胞细胞凋亡及氧化应激的影响

目的:探究不同浓度雷公藤甲素(TP)对大鼠卵巢和人卵巢颗粒细胞氧化应激及细胞凋亡的影响。方法:将32只SPF级雌性SD大鼠随机分为4组,即空白组、TP低剂量组、TP中剂量组和TP高剂量组,每组8只。TP低、中、高剂量组分别给予60、120、240μg/kg TP腹腔注射,连续14 d。称量大鼠体质量、卵巢湿重并计算卵巢指数,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)水平。苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢组织形态学,生化试剂盒检测卵巢组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)含量,二氢乙啶(DHE)染色法检测卵巢组织活性氧(ROS)水平,Western blotting检测芳香化酶(CYP19A1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cle-caspase-3)、核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)蛋白表达情况。细胞实验分为空白组、TP低剂量组、TP中剂量组和TP高剂量组,TP低、中、高剂量组人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)分别用20、40、60nmol/L TP处理。采用CCK8法检测细胞活力,ELISA检测细胞上清E2,显微镜观察明场细胞形态,TUNEL染色法检测DNA断裂情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA探针检测细胞ROS水平,Western blotting检测CYP19A1、Bcl-2、Bax、Cle-caspase-3、Nrf2、HO-1蛋白表达情况。结果:动物实验,与空白组比较,TP中、高剂量组大鼠体质量、卵巢指数明显降低,血清E2和P水平降低,FSH和LH水平升高,闭锁卵泡增多、发育卵泡减少,卵巢组织SOD、CAT酶活力下降,MDA含量增加,卵巢组织ROS水平增加,CYP19A1、Bcl-2、Nrf2、HO-1表达降低,Bax、Cle-caspase-3表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞实验,与空白组比较,TP处理组KGN细胞活力明显下降,TP中、高剂量组细胞上清E2含量减少,细胞明显出现皱缩、变圆、体积变小等现象,TUNEL阳性表达细胞数增加,细胞凋亡率明显增加,细胞ROS水平增加,CYP19A1、Bcl-2、Nrf2、HO-1表达降低,Bax、Cle-caspase-3表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:TP能引起显著的卵巢毒性,作用机制可能与氧化应激和细胞凋亡有关。

雷公藤甲素通过调控NLRP3通路抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞炎性反应

目的基于炎症小体(NLRP3)通路探讨雷公藤甲素(Triptolide TP)抑制小胶质细胞炎性反应的机制。方法脂多糖(LPS)刺激BV2小胶质细胞促细胞炎症损伤,建立体外模型,观察TP对LPS刺激的小胶质细胞的影响。BV2小胶质细胞分为对照组、LPS诱导的模型组(1 mg/L LPS)、TP组(1 nmol/L TP+1 mg/L LPS)。对照组不做处理,其它组药物作用24 h,镜下观察药物组细胞发生的形态变化并和对照组比较;细胞上清液用Griess法测定一氧化氮(NO)的释放量;免疫荧光染色和Western blot法检测各组细胞间炎症小体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-1)和白细胞介素-18(IL-18)的水平差别。结果LPS诱导BV2细胞炎性活化,形态呈阿米巴样,降低细胞活性,促进NO的释放。TP作用后降低NO水平,使NLRP3炎性小体激活受到抑制,NLRP3、ASC、caspase-1和IL-18表达水平低下。结论TP对小胶质细胞炎性反应有抑制作用,发挥了TP的抗炎作用,抑制了NLRP3炎性小体的活化和表达。

雷公藤甲素对肺动脉高压大鼠免疫炎症的影响及其作用机制

目的:分析雷公藤甲素对肺动脉高压大鼠免疫炎症的影响及其作用机制,为临床上肺动脉高压患者的治疗提供参考。方法:选取90只雄性大鼠,15只作为正常组,其余作为肺动脉高压组,皮下注射野百合碱(MCT)建立肺动脉高压模型,建模成功后肺动脉高压组分为模型组、阳性对照组、雷公藤甲素A组、雷公藤甲素B组、雷公藤甲素C组5个亚组。阳性对照组使用30 mg/kg泼生坦灌胃,雷公藤甲素A、B、C组分别腹腔注射0.1、0.2、0.4 mg/kg雷公藤甲素,正常组、模型组注射等体积生理盐水。连续干预28 d后,对比各组mPAP、RVSP,右心室肥厚指数(RVHI)、肺小动脉形态、肺小动脉重塑、免疫炎症相关指标及Toll样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)信号通路蛋白表达量。结果:①模型组、阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组mPAP、RVSP、RVHI、MT%、MA%、Th17细胞比例、IL-6、IL-17水平、TLR4、NF-κB表达量均高于正常组,Treg细胞比例、IL-10水平低于正常组(P<0.05)。②阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组mPAP、RVSP、RVHI、MT%、MA%、Th17细胞比例、IL-6、IL-17水平、TLR4、NF-κB表达量低于模型组,Treg细胞比例、IL-10水平高于模型组(P<0.05)。③雷公藤甲素A、B、C组mPAP、RVSP、RVHI、MT%、MA%、Th17细胞比例、IL-6、IL-17水平、TLR4、NF-κB表达量均低于阳性对照组,Treg细胞比例、IL-10水平高于阳性对照组(P<0.05)。④随着雷公藤甲素干预剂量增加,mPAP、RVSP、RVHI、MT%、MA%、Th17细胞比例、IL-6、IL-17水平、TLR4、NF-κB表达量逐渐降低,Treg细胞比例、IL-10水平逐渐升高(P<0.05)。结论:雷公藤甲素可修复肺动脉高压累及的心脏损伤,抑制肺小动脉重塑,分析其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路所介导的免疫反应有关,且上述作用呈剂量依赖性,高剂量雷公藤甲素作用更为明显。

雷公藤甲素通过调节miR-181b-5p/SMAD2抑制结直肠癌细胞的增殖和转移

目的识别雷公藤甲素对结直肠癌细胞增殖,迁移和侵袭的影响并识别其作用机制。方法CCK-8和EdU检测雷公藤甲素对结直肠癌细胞增殖的影响;使用Transwell检测雷公藤甲素对结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响。qRT-PCR检测结直肠癌细胞中miR-181b-5p和SMAD2 mRNA的表达;使用Western blot实验检测结直肠癌细胞中SMAD2蛋白的表达。结果CCK-8实验表明随着雷公藤甲素浓度增加,结直肠癌细胞存活率逐渐降低。EdU实验表明雷公藤甲素可显著抑制结直肠癌细胞增殖率。Transwell实验显示雷公藤甲素可显著抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭数目。qRT-PCR结果证实雷公藤甲素可显著促进miR-181b-5p的表达并抑制SMAD2 mRNA和蛋白表达。此外,过表达SMAD2可部分逆转雷公藤甲素对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结论雷公藤甲素以浓度依赖的方式抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与miR-181b-5p/SMAD2轴有关。

雷公藤甲素通过miR-34b-5p/Notch1轴抑制骨肉瘤U2OS细胞增殖并诱导其铁死亡

目的:探究雷公藤甲素(TPL)通过miR-34b-5p调控Notch1表达对骨肉瘤U2OS细胞铁死亡影响的机制。方法:常规培养U2OS细胞,将其分为对照组、TPL(10μmol/L)组、TPL(10μmol/L)+Fer-1(铁死亡抑制剂,20μmol/L)组、miR-NC组、miR-34b-5p组、miR-34b-5p+Fer-1(20μmol/L)组、TPL(10μmol/L)+anti-miR-34b-5p组、anti-miR-34b-5p+Fer-1(20μmol/L)组。qPCR法、CCK-8法、铁离子检测试剂、DHE-荧光探针和WB法分别检测各组U2OS细胞中miR-34b-5p的表达、增殖能力、Fe2+水平、ROS水平以及铁死亡相关蛋白(GPX4、SLC7A11及Notch1蛋白)的表达,双萤光素酶报告基因实验验证miR-34b-5p与Notch1的靶向结合关系。结果:TPL可促进U2OS细胞中miR-34b-5p表达,Fer-1和anti-miR-34b-5p则抑制miR-34b-5p的表达(均P<0.05)。TPL明显抑制U2OS细胞的增殖、GPX4、SLC7A11、Notch1蛋白的表达、增加细胞中Fe2+和ROS的含量,Fer-1可逆转TPL对U2OS细胞的作用(均P<0.05)。过表达miR-34b-5p与TPL对U2OS细胞的作用相似(均P<0.05)。miR-34b-5p可靶向结合Notch1(均P<0.05)。miR-34b-5p抑制剂可明显抑制TPL对U2OS细胞的影响,Fer-1可增强miR-34b-5p抑制剂的作用(均P<0.05)。结论:TPL可抑制U2OS细胞的增殖能力并促进其铁死亡,其作用机制可能与miR-34a-5p靶向调节Notch1表达有关。

川芎挥发油对雷公藤甲素体外透皮性能及细胞毒性的影响

目的探究川芎挥发油对雷公藤甲素体外透皮性能和细胞毒性的影响。方法采用气相色谱-质谱联用法对川芎挥发油的化学成分进行分析。分离KM小鼠下腹皮肤,分为雷公藤甲素、雷公藤甲素配伍川芎挥发油1∶10、1∶50、1∶100组(以下简称“配伍1∶10“”配伍1∶50”“配伍1∶100”组),将各组小鼠皮肤与相应乳膏各0.2 g充分接触24 h后,采用高效液相色谱法测定各组接收液中雷公藤甲素的累计透皮量(Q_(n)),并计算透皮吸收速率(J_(ss));再以人永生化角质形成细胞(HaCat)为模型,采用CCK-8法检测不同浓度川芎挥发油和雷公藤甲素配伍前后的细胞存活率。结果共鉴定出62个川芎挥发油化学成分,包括Z-藁本内酯、洋川芎内酯、β-瑟林烯等。与雷公藤甲素组比较,配伍1∶10组和配伍1∶50组24 h内雷公藤甲素的Q_(n)(P<0.01)和J_(ss)有所升高,而配伍1∶100组的Q_(n)(P<0.05)和J_(ss)有所下降。与雷公藤甲素组比较,雷公藤甲素浓度在36、72、144 ng/mL时,配伍1∶10组和配伍1∶50组可以显著提高HaCat细胞的存活率(P<0.05或P<0.01),而配伍1∶100组细胞的存活率反而降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论雷公藤甲素与川芎挥发油在配伍比例为1∶10和1∶50时可以促进雷公藤甲素的透皮吸收,且可降低雷公藤甲素对HaCat细胞的毒性。

雷公藤甲素调节cGAS/STING信号通路对坐骨神经痛大鼠的改善作用及机制

目的 探究雷公藤甲素(TP)对坐骨神经痛大鼠的改善作用及机制。方法 制备坐骨神经痛大鼠模型,然后将大鼠随机分为模型组(生理盐水),吲哚美辛组(阳性对照,7.5 mg/kg),低、高剂量TP干预组(分别记为TP-L组、TP-H组,50、100μg/kg TP)和高剂量TP+干扰素基因刺激因子(STING)激活剂干预组(TP-H+DMXAA组,100μg/kg TP+25 mg/kg DMXAA),每组12只;另取12只不结扎的大鼠作为假手术组(生理盐水)。腹腔注射给药/生理盐水14 d后,检测大鼠机械刺激缩足反射阈值(PWT)、热刺激缩足反射潜伏期(PWL);观察大鼠坐骨神经病理学改变、坐骨神经元形态及小胶质细胞数;检测大鼠坐骨神经中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平及环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cGAS)、STING mRNA及其蛋白表达。结果 与假手术组比较,Model组大鼠PWT、PWL均显著降低/缩短(P<0.05),尼氏体数量显著减少(P<0.05);小胶质细胞数、坐骨神经病理学评分,IL-1β、TNF-α水平,cGAS、STING mRNA及其蛋白表达水均显著增加/升高(P<0.05);坐骨神经损伤严重。与Model组比较,吲哚美辛组、TP-L组、TP-H组大鼠各指标变化与上述相反(P<0.05),坐骨神经损伤减轻。STING激活剂DMXAA减弱了TP对坐骨神经痛大鼠小胶质细胞活性和炎症反应的抑制作用(P<0.05)。结论 TP可能通过下调cGAS/STING信号通路,降低小胶质细胞活性和炎症反应,从而改善大鼠坐骨神经痛。

雷公藤甲素调控SIRT2/p53信号通路诱导肺癌A549细胞凋亡

目的 体外培养肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)细胞A549,采用不同浓度雷公藤甲素(triptolide,TP)干预,研究其通过SIRT2通路诱导肺癌细胞凋亡的作用机制,为临床治疗肺腺癌患者提供新的策略和思路。方法 采用qRT-PCR检测不同浓度(0 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L)TP对A549细胞中SIRT2相关基因表达水平;不同浓度TP对A549细胞中SIRT2相关蛋白的影响,采用Western Blot法检测。结果 基因表达水平检测结果显示,TP(60 nmol/L、80 nmol/L)与对照组TP(0 nmol/L)相比,SIRT2、MDM2、P300表达下调。同时,p53基因表达上调。Western Blot蛋白水平检测结果,TP(60 nmol/L、80 nmol/L)与对照组TP(0 nmol/L)相比,SIRT2、P300、MDM2蛋白在A549细胞中表达下降,p53蛋白表达上调,p53信号通路的Bcl-2蛋白表达抑制,增加Bax蛋白表达。结论 TP能够通过调控SIRT2/p53通路相关蛋白表达抑制肺腺癌细胞增殖并诱导其凋亡。

雷公藤甲素配伍槲皮素抗癌增效作用

目的考察雷公藤甲素与槲皮素配伍对人肺癌和食管癌细胞的抗癌增效作用。方法采用MTT法测试雷公藤甲素与槲皮素配伍前后分别对人肺癌A549和食管癌Eca9706细胞增殖抑制率,通过SPSS统计软件计算半数抑制浓度(IC50)及30%抑制浓度(IC30),通过对配伍前后雷公藤甲素对两种癌细胞抑制作用的比较分析,评价该配伍的抗癌增效作用。结果配伍槲皮素后,雷公藤甲素在0.05、0.25、0.50、1.00、2.00μmol/L对人肺癌A549细胞增殖抑制率由低浓度至高浓度依次显著升高了26.932%(P<0.01)、25.717%(P<0.01)、17.656%(P<0.01)、12.778%(P<0.05)、12.780%(P<0.05),而在雷公藤甲素4.00μmol/L时,配伍槲皮素后抑制率尽管升高了9.619%但却无显著差异(P>0.05);配伍槲皮素后,雷公藤甲素在0.05、0.25、0.50、1.00、2.00μmol/L对人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率由低浓度至高浓度依次显著升高了21.920%(P<0.01)、22.078%(P<0.01)、22.044%(P<0.01)、18.236%(P<0.01)、12.796%(P<0.05),而在雷公藤甲素4.00μmol/L时,配伍槲皮素后抑制率尽管升高了7.638%,但却无显著差异(P>0.05)。配伍槲皮素能使雷公藤甲素对A549、Eca9706细胞的IC50值分别降低了69.3%和77.7%、IC30值分别降低了89.6%和88.5%。结论雷公藤甲素配伍槲皮素对肺癌和食管癌细胞均有抗癌增效作用,并均呈现出良好的量效关系,且该配伍对肺癌增效作用的敏感度略高于对食管癌。