雷公藤甲素丁二酸单酯对A549/DDP细胞的抑制作用研究

研究雷公藤甲素丁二酸单酯(YJ-4)对A549/DDP抑制作用及其机制。以雷公藤甲素为原料,与丁二酸酐在DMAP/Pyridine催化下反应后得到化合物YJ-4,其结构经^(1)HNMR,^(13)CNMR和HR-ESI-MS表征,采用MTT法评价其对人非小细胞肺癌细胞(A549)、人肺腺癌耐顺铂株(A549/DDP)、人乳腺癌细胞(MCF-7)的体外抗肿瘤活性;不同浓度的化合物YJ-4作用于A549/DDP细胞后,DAPI染色法检测细胞核状态,PI染色法检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;分子对接软件AutoDock来评价化合物YJ-4与MDM2蛋白结合的能力。化合物YJ-4对A549/DDP((33.32±3.55)μmol/L)、A549((4.31±1.01)μmol/L)、MCF-7((16.08±2.63)μmol/L)细胞株均具有良好的细胞毒性,是阳性对照药顺铂的数倍,且通过阻滞A549/DDP细胞周期G_(2)/M期,从而诱导细胞凋亡,与MDM2的GLY-16氨基酸残基形成氢键(d=1.9),结合能(affinity)为-8.4 kcal/mol,能够较好的结合。化合物YJ-4对耐药细胞株A549/DDP细胞具有良好的细胞毒活性,其作用机制为促进A549/DDP细胞凋亡、阻滞细胞周期G_(2)/M期,可能与抑制MDM2蛋白和p53相互作用有关。

快速溶剂萃取-凝胶渗透色谱净化-液相色谱-质谱法测定动物肝组织中雷公藤甲素和雷公藤酯甲

提出了动物肝组织中雷公藤甲素与雷公藤酯甲的液相色谱-质谱法分析方法。用快速溶剂萃取仪用乙腈将动物肝组织中雷公藤甲素与雷公藤酯甲萃取到有机相,提取液经凝胶渗透色谱净化除去基质的干扰,所得洗脱液40℃氮吹挥干后用甲醇定容至0.5mL,用液相色谱-质谱法测定。雷公藤甲素与雷公藤酯甲的质量浓度均在5～1 000μg.L-1范围内呈线性,检出限(3S/N)均为1.0μg.L-1。在动物肝组织中用标准加入法做回收及精密度试验,结果为:雷公藤甲素和雷公藤酯甲的回收率分别在69.3%～77.8%,73.1%～77.2%之间;雷公藤甲素和雷公藤酯甲测定值的相对标准偏差(n=5)分别在3.2%～3.3%,2.3%～3.0%之间。

雷公藤甲素-硬脂酸酯的合成及其制剂成药性研究

目的合成一种雷公藤甲素脂溶性前药,以期提高其制剂的成药性。方法以4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化的酸与醇的DCC缩合法,合成雷公藤甲素-硬脂酸酯(TP-SA),通过质谱、核磁共振氢谱和碳谱进行结构确认;采用摇瓶法测定化合物油-水分配系数;将TP及TP-SA制备成脂质体及脂肪乳,考察其初步稳定性。结果实验结果证明:成功合成TPSA。TP-SA的log P为2.33。相同处方条件下,TP难以制备成脂质体和乳剂;TP-SA制备成脂质体粒径约90nm,制备成脂肪乳粒径约110nm,包封率均大于95%;4℃及25℃条件下观察TP-SA脂质体和脂肪乳的放置稳定性,1周内粒径、包封率等制剂参数皆无明显变化。结论 TP-SA显著改善药物制剂成药性,本研究可为TP制剂开发提供参考。

LC-MS/MS检测生物检材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲

目的建立生物检材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析方法,并进行方法学验证。方法 0.4 m L血液、尿液或0.4 g肝组织加入内标混匀后用乙酸乙酯进行提取,提取物经Allure PFP Propyl柱（100 mm×2.1 mm,5μm）分离,以甲醇-20 mmol/L乙酸铵溶液梯度洗脱,采用电喷雾正离子化（ESI＋）、多反应监测检测雷公藤甲素和雷公藤酯甲。结果各生物检材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲在相应的线性范围内线性良好（r〉0.995 0）,检出限均为2 ng/m L或2 ng/g,回收率为61.08%～102.98%,日内精密度和日间精密度均小于12.58%,准确度为90.61%～105.80%。结论所建方法简便、选择性好,适用于同时分析各种生物检材中的雷公藤甲素和雷公藤酯甲,为雷公藤中毒的法医学鉴定和临床诊治提供技术保障。

反相高效液相色谱法测定亮菌甲素琥珀酸单酯注射液含量

目的建立测定亮菌甲素琥珀酸单酯注射液中主药含量的高效液相色谱(HPLC)方法。方法以日本DL-Cl8柱(4.6mm×150mm,5μm)为色谱柱,甲醇-1%磷酸-三乙胺(45:55:0.05)为流动相,检测波长366nm,流速为0.8mL·min-1,采用HPLC法测定亮菌甲素琥珀酸单酯注射液中主药含量。结果亮菌甲素琥珀酸单酯注射液在浓度为1～100μg·mL-1范围内有良好的线性关系,相关系数为0.9999,精密度RSD为0.46%,平均加样回收率为102.25%,RSD为1.97%。结论该方法操作简单、快速、准确,可用于亮菌甲素琥珀酸单酯注射液中亮菌甲素琥珀酸单酯的含量测定。

新方法合成丁二酸单甲酯的研究

以丁二酸酐和甲醇为原料制备了丁二酸单甲酯 用环己烷作反应介质 ,操作易于控制 。

HPLC法测定人血浆中亮菌甲素琥珀酸单酯浓度

目的:建立测定人血浆中亮菌甲素琥珀酸单酯的高效液相色谱法。方法:色谱柱为DL-C_(18)(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相:甲醇-10 mmol乙酸铵水溶液-乙酸(45:55:0.5);柱温25℃,流速1.0ml·min^(-1),检测波长220 nm。结果:亮菌甲素琥珀酸单酯方法最低检测浓度为5 ng·ml^(-1),线性范围0.05～10.00μg·ml^(-1)(r=0.999 6)线性关系良好。亮菌甲素琥珀酸单酯日内RSD分别为2.09%～4.22%,日间RSD分别为3.72%～5.04%。方法回收率分别为94.38%～97.20%。结论:本试验建立的方法简便、快速、准确,适用于亮菌甲素琥珀酸单酯体内血药浓度和生物等效性的测定。

亮菌甲素琥珀酸单酯的正离子电喷雾离子阱质谱裂解途径的研究

目的采用电喷雾离子阱质谱(ESI-MS)技术对亮菌甲素琥珀酸单酯(ArAAE)的结构和裂解途径进行研究,归属其主要特征碎片离子,分析和讨论该化合物的结构和质谱特征。方法 ArAAE采用注射泵直接进样,ESI-MS检测,流速为300μL·h-1,分别获得ESI-MS1-3各个主要碎片离子。结果 ESI-MS获得了m/z 335[M1+H]+,采用ESI-MS2获得了m/z 217碎片离子,而采用ESI-MS3主要获得了m/z 189、175和161等碎片离子。ESI-MS和ESI-MS2主要有1种裂解途径,而ESI-MS3主要有3种裂解途径,主要是酯键的裂解,并对m/z 189、175和161特征碎片离子进行ESI-MS4质谱研究,推断出ArAAE有3种主要的裂解途径。结论采用ESI-MS技术对进一步研究ArAAE的体内代谢过程与结构修饰提供了实验依据。

电喷雾离子阱质谱检测亮菌甲素琥珀酸单酯的负离子裂解途径

目的采用电喷雾离子阱(ESI-MS)质谱技术研究亮菌甲素琥珀酸单酯(ArAAE)的结构和裂解途径。方法采用蠕动注射泵直接进样,ESI-MS负离子模式检查,流速为0.3 mL/h,毛细管电压为4 500 V,雾化器压力、干燥器流速和干燥器温度分别为10 psi、5 L/min和350℃,质量扫描范围m/z 100～500。结果采用ESI-MS获得了m/z 333[M-H]-,采用ESI-MS2获得了m/z 233碎片离子,而采用ESI-MS3主要获得了m/z 215,203,189,177,171,163,147和135等碎片离子。ESI-MS和ESI-MS2主要有一种裂解途径,而ESI-MS3主要有3种裂解途径,主要是酯键的裂解,并对m/z 203,189和163特征碎片离子进行ESI-MS4质谱研究,归属了其主要特征碎片离子,分析和讨论了该化合物的结构和质谱特征。结论ESI-MS负离子模式下适用于检测亮菌甲素琥珀酸单酯各级碎片裂解,归属了主要的碎片裂解途径,其方法快速、简便,为进一步研究ArAAE的体内代谢过程与结构修饰提供试验依据。

LC-MS/MS分析亮菌甲素琥珀酸单酯及其在注射液中的含量

目的:采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)并选择监测离子法测定亮菌甲素琥珀酸单酯及其在注射液中的含量。方法:样品用甲醇溶解,测定其中亮菌甲索琥珀酸单酯的含量,在负离子模式下,采用选择离子监测(SIM)方式,其监测离子对为m/z 333→233。结果:亮菌甲素琥珀酸单酯在1-100μg·ml^(-1)范围内线性关系良好(r=0.998 3),平均回收率98.6%(RSD=1.27%,n=5),检测限为2.0 ng·ml^(-1)。结论:该方法快速,灵敏,结果准确,适用于亮菌甲素琥珀酸单酯及其在注射液中的检测。

丁二酸单酯酰氯的合成工艺研究

5-氨基乙酰丙酸作为一种新型光动力化合物在医学和农业领域具有广泛的应用.笔者以丁二酸酐、甲醇为主要原料,合成了5-氨基乙酰丙酸的第一步反应中间体丁二酸单酯酰氯.产物的收率从物料比、反应时间、反应温度等影响因素进行了优化,找到了最佳的反应条件,为5-氨基乙酰丙酸的工业生产提供有价值的参考.

雷公藤内酯醇衍生物对肝癌细胞增殖、凋亡的作用研究

目的研究新型雷公藤内酯醇(Triptolide,TPL)衍生物对正常肝细胞的毒性以及对肝癌细胞的增殖、凋亡作用。方法通过对TPL进行化学修饰,获得2种新型衍生物:雷公藤内酯三醇(TP-3-OH)和丙烯酸雷公藤甲素酯(TPO)。通过体外培养人胚胎肝细胞LO2和肝癌细胞Hep G2、Hep3B、SMMC-7721,分为DMSO对照组,TPL/TP-3-OH/TPO低、中、高浓度组(25、50、100 nmol·L^(-1))。通过检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的活性来评价TP-3-OH、TPO对肝细胞的毒性;采用MTT实验检测细胞增殖情况;采用流式细胞术及Western Blot法检测细胞凋亡及凋亡通路相关蛋白表达情况;采用划痕实验检测细胞迁移能力。结果与TPL组比较,50、100 nmol·L^(-1)浓度条件下TP-3-OH、TPO组的LO2细胞培养上清中的LDH活性明显降低(P<0.05,P<0.01)。与DMSO对照组比较,TPO中、高浓度(50、100 nmol·L^(-1))组的LO2细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05,P<0.01),TPO低、中、高浓度(25、50、100 nmol·L^(-1))组的Hep G2、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞增殖抑制率均明显升高(P<0.05,P<0.01);TPO高浓度(100 nmol·L^(-1))组的LO2、Hep G2和SMMC-7721细胞的早期、晚期细胞凋亡率均明显升高(P<0.05,P<0.01);TPO中、高浓度(50、100 nmol·L^(-1))组SMMC-7721、Hep G2细胞的cleaved-Caspase-3、cleaved-PARP蛋白表达显著上调(P<0.01);TPO中浓度(50 nmol·L^(-1))组SMMC-7721细胞的24 h迁移率明显降低(P<0.05)。结论经化学修饰获得的2种新型TPL衍生物对肝细胞的毒性降低,其中TPO具有抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡的作用。

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对免疫性肝损伤的保护作用及其机制研究

目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对雷公藤甲素(TP)诱导的免疫性肝损伤的保护性作用及其作用机制。方法:雌性C57BL/6小鼠随机分为4组,即正常对照组、EGCG对照组、TP组、EGCG治疗组。以赖氏法检测血清中ALT水平,以分光光度法检测肝匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的变化情况,以HE染色观测小鼠肝脏组织形态学变化,以ELISA方法检测肝脏中白细胞介素(IL)-17和IL-6的表达水平,以Western blot方法检测肝脏中Toll样受体4(TLR4)的表达情况。结果:TP组小鼠血清转氨酶水平明显高于正常对照组(P<0.005),EGCG对照组与正常对照组比较无变化(P>0.05),而EGCG治疗组小鼠血清转氨酶水平与TP组相比下降明显(P<0.005)。TP组小鼠肝脏病理切片示较多肝细胞坏死和中性粒细胞浸润,EGCG对照组和正常对照组小鼠肝脏形态学基本正常,EGCG治疗组示肝细胞炎症坏死程度较TP组有大幅减轻。TP组小鼠肝脏中MDA、IL-17及IL-6水平明显高于正常对照组(P<0.005),而SOD和GSH水平明显低于正常对照组(SOD,P<0.05;GSH,P<0.005),EGCG对照组与正常对照组比较无变化(P>0.05),EGCG治疗组小鼠肝脏中MDA、IL-17及IL-6水平均下降明显(P<0.005),而SOD和GSH水平均增高,与TP组比较有显著性差异(SOD,P<0.05;GSH,P<0.005)。TP组肝脏TLR4蛋白表达水平高于正常对照组,EGCG对照组与正常对照组比较无变化(P>0.05),而EGCG治疗组TLR4水平显著降低。结论:EGCG对TP所致小鼠肝损伤有明显的保护作用,可能与其抗氧化作用及对炎症因子的调节有关。

气相色谱法测定丁二酸酯化液中有机组分的含量

针对丁二酸酯化液的特点,选择强极性毛细管柱作为分析柱,优化得到了分析测试条件,利用气相色谱建立了丁二酸二甲酯、丁二酸单甲酯和甲醇的标准曲线。在测试确认模拟混合样品的分析精度的基础上,分析了丁二酸酯化反应液样品中有机组分浓度。分析结果表明,该方法快速、准确、灵敏度高、重复性好,相对标准偏差(RSDs,n=7)在2%以内,能满足丁二酸酯化反应过程特性研究的分析要求。

表没食子儿茶素没食子酸酯对雷公藤甲素诱导的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用

颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，在卵泡发育中起着重要的作用。卵巢颗粒细胞的正常增殖与分化直接影响着卵泡的生长、发育、排卵、黄体形成以及激素分泌等卵巢的基本功能。卵巢颗粒细胞损伤会严重影响卵巢功能，甚至可能导致卵巢早衰。

亮菌甲素琥珀酸单酯的电化学行为及其测定

目的:建立循环伏安法研究亮菌甲素琥珀酸单酯在玻碳电极上的电化学行为,并建立差示脉冲伏安法测定含量。方法:采用三电极系统(玻碳电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,Pt电极为对电极),以pH 4.75醋酸钠缓冲液作为电解质,采用差示脉冲伏安法测定亮菌甲素琥珀酸单酯注射液中主药含量。结果:亮菌甲素琥珀酸单酯的氧化峰电流与其浓度呈良好的线性关系,线性范围为5.0×10-7～2.0×10-5mol.L-1;检测限为5.0×10-8mol.L-1。结论:该方法灵敏度高、检测范围宽,结果令人满意,可用于亮菌甲素琥珀酸单酯注射液中亮菌甲素琥珀酸单酯的含量测定。

基于TPGs表面修饰的雷公藤甲素固体脂质纳米粒的制备与质量评价

目的制备D-α-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGs)修饰的雷公藤甲素固体脂质纳米粒(TPGs-Tri-SLNs),并评价其质量。方法采用热熔乳化-超声法制备TPGs-Tri-SLNs,并以山嵛酸甘油酯浓度(X1),大豆磷脂与TPGs比例(X2)和山嵛酸甘油酯与药物比例(X3)作为考察因素,以TPGs-Tri-SLNs的粒径分布(Y1)和药物包封率(Y2)作为评价指标,通过中心复合设计-效应面法优化TPGs-Tri-SLNs的处方,粒度分析仪测定其粒径分布,透射电镜观察其微观形态,并考察了TPGs-Tri-SLNs的体外药物释放特性。结果TPGs-Tri-SLNs的最佳处方组成为:山嵛酸甘油酯浓度为10%,大豆磷脂与TPGs比例4∶1,山嵛酸甘油酯与药物比例为60∶1,按照最优处方制备3批TPGs-Tri-SLNs的平均粒径为(107.8±16.9)nm,包封率为91.4%±1.1%;在透射电镜下可以观察到TPGs-Tri-SLNs呈球型分布,表面光滑;TPGs-Tri-SLNs在前4 h内药物释放较快,后期释药速率较为平稳,24 h药物释放可以达到85%。结论通过中心复合设计-效应面法优化并得到TPGs-Tri-SLNs的最优处方,处方设计合理,制备工艺简单。

丙烯酸-2,4,6-三硝基苯乙酯的合成及热分解

以TNT、甲醛为原料,在弱碱性条件下反应合成得到2,4,6-三硝基苯乙醇(PicCH2CH2OH);PicCH2CH2OH在浓硫酸催化下和丙烯酸在甲苯中回流反应24h,合成得到丙烯酸-2,4,6-三硝基苯乙酯,产率为62%。采用紫外可见光谱(UV-Vis)、核磁共振氢谱(1HNMR)、红外光谱(FTIR)、质谱(MS)以及元素分析等对产物结构进行了表征。利用热重分析(TG)对产物热稳定性进行了研究,采用Kissinger方法和Ozawa方法计算其热分解活化能Ea分别为99.78,102.96kJ·mol-1。

LC-MS/MS法测定人血浆中ASE浓度

目的 建立LC-MS/MS法测定人血浆中亮菌甲素琥珀酸单酯（ASE）的方法.方法 ZorbaxSB-C18色谱柱（30 mm ×2.1 mm,3.5 μm）,流动相：甲醇-20 mM乙酸铵水溶液梯度洗脱,柱温：30℃,流速：0.4 mL/min.以补骨脂甲素为内标,在负离子模式下,采用选择离子监测（SIM）方式,监测离子对分别为m/z333→233和m/z 323→221.结果 ASE LC-MS/MS法的最低检测浓度为0.5 ng/mL,在0.01 ～ 10.0μg/mL（r =0.9914）内线性关系良好.该方法下ASE日内精密度RSD分别为2.18％ ～5.62％,日间精密度RSD分别为4.72％ ～6.23％.方法回收率分别为93.2％～109.2％.结论 本试验建立的方法准确、快速、简便,适用于ASE体内血药浓度和生物等效性的测定.