间充质干细胞外泌体调节哺乳动物雷帕霉素靶点/p70核糖体蛋白S6激酶/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白通路改善糖尿病肾病大鼠肾损伤的机制研究

目的探讨间充质干细胞外泌体(MSC-EVs)通过调节哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(S6K1)/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白(Beclin 1)通路改善糖尿病肾病(DN)大鼠肾损伤的机制。方法采用高脂饮食联合腹腔链脲佐菌素(STZ)注射的方法建立SD大鼠DN模型,随机分为模型组、MSC-EVs组、MSC-EVs+MHY1485(mTOR激活剂)组,每组12只。另取12只SD大鼠以正常饲料喂养6周后,腹腔注射同等剂量柠檬酸钠溶液作为对照。以MSC-EVs和MHY1485分组处理后,检测大鼠血糖及肾功能指标[血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、尿微量白蛋白(UmALB)]水平。采用苏木精-伊红(HE)染色检测各组大鼠肾组织病理形态;采用免疫组化检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路相关蛋白表达;采用蛋白免疫印迹法检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路及自噬相关蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠肾组织形态发生损伤,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,MSC-EVs组大鼠肾组织形态损伤减轻,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著降低(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著升高(P<0.05);与MSC-EVs组相比,MSC-EVs+MHY1485组大鼠肾组织形态损伤加重,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05)。结论MSC-EVs可增强自噬,降低DN大鼠血糖、SCr、BUN和尿蛋白水平,减轻肾组织损伤,其机制可能与抑制mTOR/S6K1/Beclin 1通路激活有关。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2靶向治疗肿瘤的研究进展

小分子抑制剂选择性的靶向杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞无毒副作用,显示出很好的抗肿瘤前景。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)是一个非常有希望的靶点,最近研究发现mTORC2的活性在多种肿瘤的形成和侵袭中是必不可少的,而且mTORC2抑制剂靶向治疗肿瘤有着广泛的影响。本文就mTORC2的生物学特性及以mTORC2为靶点治疗肿瘤的前景进行综述。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2/Akt信号通路对6-羟基多巴胺处理的SH-SY5Y细胞模型的作用及分子机制

目的探讨调控哺乳动物雷帕霉素蛋白复合物2(mTORC2)/Akt信号通路对6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的SH-SY5Y细胞系是否具有保护作用,并阐明其分子作用机制。方法经维甲酸(RA)处理的SH-SY5Y细胞分别给予6-OHDA、mTORC2信号通路抑制剂PP242和激动剂A-443654,通过免疫荧光染色观察各组细胞数目的变化;提取细胞总蛋白进行Western blotting和免疫共沉淀(CoIP)实验,明确mTORC2信号通路关键蛋白的表达水平及其相互作用;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。同时制备SH-SY5Y与Bv-2细胞系共培养的帕金森病(PD)模型,运用MTT及ELISA方法检测各组细胞活力及培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素β(IL-1β)的含量。结果6-OHDA损伤的PD细胞模型组酪氨酸羟化酶(TH)/增殖细胞核抗原(PCNA)/Hochest-、TH/5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)-单标或双标阳性细胞数较正常组明显减少,凋亡率升高;Rictor、p-Akt、发育及DNA损伤反应调节蛋白1(REDD1)的表达均上升,且Rictor与p-Akt或REDD1存在相互作用;共培养模型中细胞活力明显降低且上清液中TNF-α和IL-β含量上升。A-443654组随着上述蛋白表达的进一步上调,细胞存活和凋亡以及炎性因子水平均有明显改善,而PP242组则呈现相反的变化。结论A-443654通过使Akt磷酸化而激活mTORC2信号通路,引起Rictor和REDD1蛋白的表达增加,继而提高细胞存活率并降低凋亡率,促进SH-SY5Y细胞的增殖分化,改善了6-OHDA引起的细胞损伤以及抑制了炎症因子的释放。

吡柔比星通过抑制雷帕霉素信号通道的哺乳动物靶点引发人膀胱癌细胞自体吞噬反应

目前吡柔比星广泛用于膀胱灌注治疗膀胱癌,但是其疗效因耐药性会受到一定的影响,目前吡柔比星的作用机制还没得到完全的阐述。本研究通过吡柔比星、siRNA 和3-甲基腺嘌呤或羟氯喹处理膀胱癌细胞 EJ、J82,采用细胞活力分析仪和流式细胞仪分别检测膀胱癌细胞的增殖和凋亡。处理前后通过免疫印迹法评估自体吞噬情况,同时检测雷帕霉素的磷酸化哺乳动物靶点、p70核糖体蛋白 S6激酶和真核起始因子4E 结合蛋白,旨在研究自体吞噬在膀胱癌吡柔比星灌注治疗中的作用。

mTOR活化对抗β_2GPI抗体/β_2GPI复合物诱导THP-1细胞组织因子表达的影响

目的探讨雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在抗β_2糖蛋白I(β_2GPI)/β_2GPI复合物诱导THP-1细胞组织因子(TF)表达中的作用。方法用抗β_2GPI抗体/β_2GPI和β_2GPI/Ig G-APS处理THP-1细胞,mTOR抑制剂雷帕霉素(100 nmol/L)进行干预实验;收集细胞总RNA和蛋白质,实时定量PCR(RT-q PCR)和TF活性试剂盒分别检测THP-1细胞中TF mRNA表达水平及其活性,western blot检测THP-1细胞中mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、NF-κB p65和p-NF-κB p65的表达情况。结果抗β_2GPI抗体/β_2GPI和β_2GPI/Ig G-APS复合物均能明显增加THP-1细胞TF mRNA和TF活性以及mTOR磷酸化水平(P均<0.05);雷帕霉素能明显降低抗β_2GPI抗体/β_2GPI和β_2GPI/Ig G-APS诱导THP-1细胞TF的表达水平以及mTOR磷酸化的效应(P均<0.05),也能明显地削弱p38、ERK1/2和NF-κB p65的磷酸化水平(P均<0.05),而对JNK的磷酸化水平无抑制效应(P>0.05)。结论抗β_2GPI抗体/β_2GPI复合物能够刺激THP-1细胞mTOR的活化,并能影响TF的表达。

雷帕霉素、RAD001抑制胃癌细胞株MKN-28、MKN-45细胞生长的实验研究

目的探讨雷帕霉素(rapamycin)、RAD001(everolimus)对胃癌细胞株MKN-28、MKN-45细胞生长的影响,并对其机制进行初步探讨。方法体外培养人胃癌MKN-28、MKN-45细胞,给予雷帕霉素、RAD001干预后通过细胞计数、流式细胞术检测肿瘤细胞生长、细胞周期分布情况。结果雷帕霉素、RAD001均可抑制MKN-28、MKN-45细胞生长,抑制作用具有时间依赖性,雷帕霉素作用于MKN-28、MKN-45两种细胞株72 h抑制率分别为23.40%、36.26%;RAD001作用于MKN-28、MKN-45两种细胞株72 h抑制率分别为25.12%、40.11%。72 h时RAD001组与阴性对照组、DMSO对照组相比,MKN-28、MKN-45细胞计数差异有显著性(P<0.05)。RAD001作用24 h后MKN-28、MKN-45细胞周期发生改变,停滞在G0-G1期细胞比例增加。RAD001组与阴性对照组、DMSO对照组相比,MKN-45细胞周期差异有显著性(P<0.05),MKN-28细胞周期差异无显著性(P>0.05)。结论两种药物相比较,RAD001相对敏感;两株细胞相比较,MKN-45相对敏感。RAD001通过调节细胞周期进而抑制胃癌细胞的增殖。

C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白13通过单磷酸腺苷激活的蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶点复合物通路对高糖诱导的大鼠原代肝窦内皮细胞自噬功能影响的研究

目的探讨C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白13(CTRP13)通过单磷酸腺苷激活的蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶点复合物(AMPK/mTOR)通路对高糖诱导的大鼠原代肝窦内皮细胞(rLSECs)自噬功能的影响。方法分离、鉴定、培养rLSECs,分为正常对照(NC)组、高糖(HG)组、HG+LV-CTRP13组、HG+慢病毒空载体(LV-Con)组(HG+LV-Con),构建CTRP13慢病毒过表达载体(LV-CTRP13)及慢病毒空载体(LV-Con)并转染r LSECs,分别使用AMPK抑制剂Compound C、mTOR抑制剂Torin1、自噬抑制剂3MA干预,分为HG+LV-Con+Compound C组、HG+LV-CTRP13+Compound C组、HG+LV-Con+Torin1组、HG+LV-CTRP13+Torin1组、HG+LV-Con+3MA、HG+LV-CTRP13+3MA组。透射电子显微镜观察自噬小体,qRT-PCR、Western blot法检测各组CTRP13、自噬相关蛋白Beclin1、人微管相关蛋白轻链3II(LC3II)、人质膜膜泡关联蛋白(PLVAP)及p-AMPK、p-mTOR mRNA和蛋白表达。结果与NC组比较,HG、HG+LV-CTRP13组自噬小体数量降低(P<0.05)。与HG组比较,HG+LV-CTRP13组自噬小体数量升高(P<0.05)。NC、HG+LV-CTRP13组CTRP13 mRNA和蛋白表达高于HG、HG+LV-Con组(P<0.05)。HG+LV-CTRP13组Beclin1、LC3II、p-AMPK、AMPK mRNA表达,Beclin1、LC3II/LC3I蛋白表达高于HG、HG+LV-Con组(P<0.05),PLVAP、p-mTOR、mTOR mRNA表达,PLVAP蛋白表达低于HG、HG+LV-Con组(P<0.05)。与HG+LV-CTRP13比较,HG+LV-CTRP13+Compound C组p-mTOR蛋白表达升高(P<0.05),CTRP13、Beclin1、LC3II/LC3I蛋白表达降低(P<0.05),HG+LV-CTRP13+Torin1组p-AMPK、Beclin1、LC3II/LC3I蛋白表达升高(P<0.05),CTRP13、p-mTOR蛋白表达降低(P<0.05),HG+LV-CTRP13+3MA组p-AMPK、p-mTOR、LC3II/LC3I蛋白表达升高(P<0.05),LC3II/LC3I蛋白表达降低(P<0.05)。结论CTRP13过表达通过激活AMPK/mTOR信号通路对rLSECs自噬功能发挥保护作用,延缓肝窦毛细血管化。

ox-LDL/β2GPI/aβ2GPI复合物促进小鼠RAW264.7细胞凋亡和炎症因子表达

目的 探讨氧化型低密度脂蛋白/β2糖蛋白I/抗β2糖蛋白I抗体(ox-LDL/β2GPI/aβ2GPI)复合物对小鼠RAW264.7细胞凋亡和炎症因子表达的影响及机制。方法 分别用培养基、ox-LDL、β2GPI/抗β2GPI抗体复合物、ox-LDL/β2GPI复合物、ox-LDL/抗β2GPI抗体复合物和ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物处理细胞。用TAK-242阻断Toll样受体4(TLR4)、雷帕霉素(rapamycin)阻断哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)探究相关通路的作用。最后,用不同浓度的TNF-α刺激细胞。用凋亡试剂盒检测细胞的凋亡,实时定量PCR检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)的mRNA表达,Western blot法检测TNF-α、IL-1β、裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)的蛋白水平。结果 ox-LDL/β2GPI/aβ2GPI复合物能够诱导细胞凋亡、Bcl2表达降低、c-caspase-3表达增加,还可促进TNF-α和IL-1β表达,通路抑制剂可部分减轻凋亡水平和炎症因子表达;一定浓度的TNF-α可促进细胞凋亡。结论 ox-LDL/β2GPI/aβ2GPI复合物通过TLR4、mTOR通路诱导RAW264.7细胞表达炎症因子,促进细胞凋亡。

雷帕霉素对人骨肉瘤CD133^(+)U2OS细胞增殖和干性维持的影响

目的探讨雷帕霉素对人骨肉瘤CD133^(+)U2OS细胞增殖和干性维持的影响。方法(1)自U2OS细胞中分离CD133^(+)U2OS细胞,分为预对照组、低剂量雷帕霉素组和高剂量雷帕霉素组,分别加入含0 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL雷帕霉素进行培养。干预24 h、48 h、72 h后检测各组细胞的增殖抑制情况,然后选择适宜的干预剂量和时间进行后续试验。(2)将CD133^(+)U2OS细胞分为对照组和雷帕霉素组,分别使用不含雷帕霉素的培养基、含雷帕霉素的培养基培养。干预48 h后检测两组细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR及干性标志蛋白[SRY盒转录因子2(Sox2)、八聚体结合转录因子4(Oct4)]的相对表达量。结果(1)与预对照组相比,低剂量雷帕霉素组和高剂量雷帕霉素组细胞的增殖均受到抑制,且随着干预时间的延长和剂量的增加细胞增殖抑制率有增高的趋势(均P<0.05)。故在后续实验选择100 ng/mL雷帕霉素干预48 h。(2)雷帕霉素组mTOR、磷酸化mTOR、Sox2、Oct4的相对表达量均较对照组降低(均P<0.05)。结论雷帕霉素能够抑制人骨肉瘤CD133^(+)U2OS细胞的增殖和干性维持,这可能与其降低mTOR信号通路活性有关。

儿童特发性肾病综合征低IgG血症机制:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白过表达对滤泡辅助性T细胞数量的可能影响

目的探讨儿童特发性肾病综合征(INS)的低免疫球蛋白(Ig)G血症可能机制。方法选择2015年9月至2016年10月,于深圳市儿童医院接受治疗的40例激素敏感型INS患儿为研究对象。按照患儿病情,将其分为INS初发组(n=20)和INS缓解组(n=20),选择同期在该院接受健康体检的同年龄健康儿童纳入对照组(n=20)。采用流式细胞术(FCM)检测受试儿外周血单个核细胞(PBMC)中滤泡辅助性T细胞(Tfh,CD4+CXCR5+ICOShighT)、初始B细胞(CD19+CD27-IgD+B细胞)、转化前记忆B细胞(CD19+CD27+IgD+B细胞)、转化后记忆B细胞(CD19+CD27+IgD-B细胞)及浆细胞(CD19+CD27+IgD-CD38highB细胞)百分比;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测受试儿外周血CD4+T细胞相关基因mRNA表达水平;采用酶联免疫吸附试验、免疫荧光吸附试验,分别检测受试儿血浆白细胞介素(IL)-2水平、丙二醛浓度。采用单因素方差分析及最小显著性差异(LSD)-t法,对上述指标分别进行3组间及组间两两比较;对其中部分指标的相关性,采用Pearson相关分析法。本研究通过深圳市儿童医院伦理委员会批准(批准日期:2016-04-11),所有受试对象监护人知情并同意。结果①INS初发组患儿血清总蛋白及白蛋白水平,以及血浆总IgG、IgG1、IgG2、IgG4水平等6项指标,均显著低于对照组健康儿童,血清总胆固醇浓度,则显著高于对照组,并且差异均有统计学意义(P<0.05)。②INS初发组患儿PBMC中Tfh百分比为(3.9±1.2)%,显著低于对照组的(5.2±1.1)%及INS缓解组的(4.9±1.2)%,并且差异均有统计学意义(P=0.001,P=0.021)。③INS初发组患儿PBMC中,转化后记忆B细胞、浆细胞百分比为(8.4±3.6)%、(7.5±2.0)%,均低于INS缓解组患儿的(11.6±2.7)%、(11.4±3.9)%及对照组健康儿童的(12.2±3.7)%、(12.5±3.4)%,并且差异均有统计学意义(均为P<0.001)。④INS初发组患儿的8项指标,如CD4+T细胞相关基因B淋巴细胞诱导成熟蛋白(Blimp)-1、IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及雷帕霉素结合蛋白复合物(mTORC)1mRNA表达水平为(3.2±1.1)、(14.4±5.7)、(18.5±4.6)、(7.2±1.7)、(10.3±3.6)、(2.2±0.3)、(1.84±0.68)、(7.2±1.4),均高于INS缓解组患儿的(2.4±1.1)、(10.5±2.5)、(15.5±3.5)、(5.5±1.1)、(8.5±2.2)、(1.8±0.5)、(1.44±0.29)、(6.1±1.2)及对照组健康儿童的(2.4±1.1)、(10.3±5.5)、(14.6±4.8)、(5.6±2.5)、(1.56±0.42)、(2.4±1.1)、(10.3±5.5)、(14.6±4.8);而B细胞淋巴瘤因子(BCL)-6 mRNA表达水平为(1.22±0.29),则低于INS缓解组患儿的(1.49±0.35)及对照组健康儿童的(1.56±0.42),并且上述差异均有统计学意义(均为P<0.05)。⑤INS初发组患儿血浆IL-2水平及丙二醛浓度为(28.9±6.1)ng/L、(15.0±9.2)μmol/L,均高于INS缓解组患儿的(18.0±5.9)ng/L、(7.3±5.4)μmol/L及对照组健康儿童的(16.2±7.6)ng/L、(8.8±5.1)μmol/L,并且差异均有统计学意义(P<0.001、P=0.022,P<0.001、P=0.004)。⑥INS缓解组患儿与对照组健康儿童上述21项指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。⑦60例受试儿PBMC中Tfh百分比与血浆IgG水平、浆细胞百分比,均呈正相关关系(r=0.692、0.809,P<0.001)。INS初发组20例患儿血浆丙二醛浓度与mTOR、mTORC1mRNA表达水平,亦均呈正相关关系(r=0.627、P=0.003,r=0.794、P<0.001)。结论INS患儿PBMC中Tfh百分比下降影响B细胞分化成熟,可能是导致患儿低IgG血症的原因之一。血浆IL-2水平升高和高脂血症导致的mTOR和mTORC1过表达,可能是抑制INS患儿Tfh分化的重要原因。

雷帕霉素抑制人结肠癌细胞体外增殖及其机制研究

目的研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR特异性抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)对体外培养的人结肠癌Lovo细胞生长的抑制作用,并初步探讨其机制。方法分别用0.5、1.0、2.5和5.0μg/mL雷帕霉素对Lovo细胞进行干预,采用MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Westernblot检测凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达。结果雷帕霉素对Lovo细胞表现出明显的增殖抑制作用,细胞增殖活性随浓度增加、时间延长逐渐降低,呈现量-效、时-效关系。雷帕霉素呈浓度依赖性诱导细胞凋亡,并明显降低Lovo细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达水平。结论雷帕霉素通过下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,诱导结肠癌Lovo细胞凋亡,从而抑制其增殖及生长。

mTORC2缺陷通过调控致病性CD4^(+)T细胞铁死亡改善小鼠骨关节炎的机制

目的探讨mTORC2缺陷通过调控致病性CD4^(+)T细胞铁死亡改善小鼠骨关节炎(OA)的机制。方法60只小鼠随机分为对照、OA、mTORC2^(-/-)+OA、mTORC2^(-/-)+OA+Erastin组(n=16)。利用正常和mTORC2^(-/-)小鼠通过手术构建右膝OA模型。腹腔注射40 mg/kg的Erastin诱导铁死亡。检测软骨退化、关节炎症和铁死亡水平,免疫染色检测T-bet和RORγt评估致病性CD4^(+)T细胞Th1和Th17水平。结果OA组膝关节组织中mTORC2表达水平(0.69±0.08)高于对照组(0.16±0.03)(t=24.813,P<0.01)。OA组的OARSI评分[(4.17±0.59)分]显著高于对照组[(1.05±0.13)分](t=20.657,P=0.001),mTORC2^(-/-)+OA组的OARSI评分[(1.82±0.23)分]显著低于OA组(t=16.844,P=0.001),mTORC2^(-/-)+OA+Erastin组的OARSI评分[(3.81±0.43)]显著高于mTORC2^(-/-)+OA组(t=16.323,P=0.001)。与对照组比较,OA组的IL-1β[(22.75±2.06)μg/mL]和IL-6[(31.26±2.97)μg/mL]升高(t=31.237,P=0.001;t=30.390,P=0.001);mTORC2^(-/-)+OA组的IL-1β[(10.54±1.25)μg/mL]和IL-6[(13.56±1.29)μg/mL]显著低于OA组(t=20.269,P=0.001;t=21.865,P=0.001);mTORC2^(-/-)+OA+Erastin组的IL-1β[(19.86±2.13)μg/mL]和IL-6[(27.12±3.04)μg/mL]显著高于mTORC2^(-/-)+OA组(t=15.095,P=0.001;t=16.425,P=0.001)。OA组的GPX4蛋白相对表达水平(0.11±0.02)低于对照组(0.78±0.07),而AC-SL4相对表达水平(0.65±0.07)高于对照组(0.19±0.03)(t=36.813,P=0.001;t=24.160,P=0.001),mTORC2^(-/-)+OA组的GPX4蛋白相对表达水平(0.63±0.07)高于OA组,而ACSL4相对表达水平(0.30±0.04)低于OA组(t=28.571,P=0.001;t=17.365,P=0.001),mTORC2^(-/-)+OA+Erastin组的GPX4蛋白相对表达水平(0.23±0.03)低于mTORC2^(-/-)+OA组,而ACSL4蛋白相对表达水平(0.57±0.06)高于mTORC2^(-/-)+OA组(t=21.009,P=0.001;t=14.977,P=0.001)。OA组Th1和Th17细胞水平[(25.36±1.67)%、(21.42±1.85)%]显著高于对照组[(2.63±0.26)%、(1.92±0.28)%](t=53.795,P=0.001;t=41.752,P=0.001),mTORC2^(-/-)+OA组的Th1和Th17细胞水平[(9.35±1.02)%,(8.41±0.96)%]显著低于OA组(t=32.726,P=0.001;t=24.968,P=0.001),mTORC2^(-/-)+OA+Eras-tin组的Th1和Th17细胞水平[(22.54±1.79)%、(19.06±1.74)%]显著高于mTORC2^(-/-)+OA组(t=25.609,P=0.001;t=21.437,P=0.001)。结论mTORC2通过调控铁死亡抑制致病性CD4^(+)T细胞改善小鼠OA炎症。

雷帕霉素及其衍生物治疗局灶节段性肾小球硬化

局灶节段性肾小球硬化(FSGS)治疗药物有限,亟待探讨新的治疗药物。近年研究证实,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)过度活化介导足细胞损伤和FSGS发病机制。mTORC1抑制剂雷帕霉素及其衍生物理论上可抑制足细胞过度活化的mTORC1,从而保护足细胞,目前已被用于FSGS患者的临床试验,然而其在部分患者显现的肾脏不良反应限制了此药的进一步应用。本文对雷帕霉素及其衍生物用于FSGS治疗的相关研究进展加以综述。

雷帕霉素对衰老细胞生物节律关键基因的调控作用观察

目的观察雷帕霉素对衰老细胞生物节律关键基因的调控作用。方法通过传代诱导人皮肤成纤维细胞复制性衰老,获得衰老的人皮肤成纤维细胞。加入50%的马血清刺激诱导细胞同步化,将细胞分为观察组和对照组,分别加入100 mmol/L的雷帕霉素和DMSO培养24 h。采用荧光定量PCR法检测生物节律关键基因芳烃受体核转位蛋白3(BMAL1)、节律周期蛋白2(PER2)、蓝光受体蛋白1(CRY1)、孤儿核受体α(Rev-erbα)、孤核受体α(Rorα)mRNA表达,利用JTK-CYCLE软件分析各基因的节律周期,Western blotting法检测BMAL1、PER2、CRY1蛋白表达。结果观察组PER2、CRY1、Rev-erbα、RorαmRNA表达高于对照组(P均<0.05)。对照组BMAL1、CRY1、Rev-erbα、Rorα基因的节律周期为24 h,PER2基因的节律周期为28 h。观察组BMAL1、CRY1、Rorα基因的节律周期为24 h,Rev-erbα基因的节律周期为27.5 h,PER2的节律周期为24 h。观察组CRY1蛋白表达高于对照组(P<0.05),PER2蛋白表达低于对照组(P<0.05),两组BMAL1 mRNA及蛋白表达比较无统计学差异。结论雷帕霉素可以提高衰老的人皮肤成纤维细胞生物节律关键基因BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、RorαmRNA的表达,缩短PER2的节律周期,对紊乱的节律钟功能具有调控作用。

大黄素调控树突状细胞Tsc1/mTORC1通路对Th1/Th2细胞极化治疗脓毒症的影响

目的探讨大黄素(Emo)调控树突状细胞结节性硬化症复合体1(Tsc1)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)通路对Th1/Th2细胞极化治疗脓毒症的影响。方法将小鼠分对照组、模型组(采用盲肠结扎和穿刺法构建小鼠脓毒症模型)、模型+Emo组;采用脂多糖(LPS)构建树突状细胞(通过小鼠股骨骨髓获取)脓毒症模型,分为对照组、LPS组、LPS+Emo组;采用Transwell构建树突状细胞与CD4^(+)T细胞(通过腹腔灌洗液获取)共培养体系,分为LPS组、LPS+Emo组、LPS+Emo+sh-NC组、LPS+Emo+sh-Tsc1组细胞;采用HE染色观察各组小鼠心、肺、肝组织损伤情况;采用流式细胞术分离CD4^(+)T细胞,以及检测Th1和Th2细胞分化情况;采用ELISA法检测小鼠血清中TNF-α和IL-1β的表达情况以及小鼠脾脏和树突状细胞培养上清液中IL-12和IL-4的表达情况;采用Western blot法检测各组小鼠脾脏和各组树突状细胞中Tsc1和mTORC1信号通路关键蛋白(S6、pS6)的表达情况。结果小鼠体内模型中,与对照组相比,模型组小鼠心、肝、肺显著损伤,脾脏中TNF-α和IL-1β表达显著升高,Th1/Th2细胞比例显著升高,Tsc1蛋白表达显著降低,S6蛋白磷酸化水平显著增高;与模型组相比,模型+Emo组小鼠心、肝、肺组织损伤部分恢复,脾脏中TNF-α和IL-1β表达显著降低,Th1/Th2细胞比例显著降低,Tsc1蛋白表达显著升高,S6蛋白磷酸化水平显著降低。体外树突状细胞模型中,与LPS组相比,LPS+Emo组细胞培养上清液中Tsc1蛋白表达升高,pS6蛋白表达降低,IL-12和IL-4表达显著降低,Th1/Th2细胞比例显著降低;抑制Tcs1表达后,与LPS+Emo+sh-NC组相比,LPS+Emo+sh-Tsc1组细胞培养上清液中IL-12和IL-4表达显著升高,Tsc1蛋白表达降低,pS6蛋白表达升高,Th1/Th2细胞比例显著升高。结论Emo对脓毒症有明显的治疗作用,其作用机制可能为通过调控树突状细胞中Tsc1/mTORC1通路,影响树突状细胞分泌T细胞极化因子IL-12和IL-4,从而影响Th1/Th2细胞极化以治疗脓毒症。

UBE2O在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

目的:研究泛素结合酶E2O(ubiquitin conjugating enzyme E2 O,UBE2O)在胃癌组织中的表达及临床意义,明确UBE2O对胃癌细胞增殖和侵袭的影响,并初步探索潜在分子机制。方法:利用癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析UEB2O mRNA在胃癌及正常组织中的表达差异;通过免疫组化染色明确UBE2O蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达情况;在AGS和SGC-7901细胞中转染UBE2O shRNA,CCK-8和Trasnwell实验检测细胞增殖和侵袭能力;蛋白质免疫印记实验检测AMP活化蛋白激酶α2(AMP-activated protein kinaseα2,AMPKα2)、磷酸化雷帕霉素机制靶点(phosphorylated mechanistic target of rapamycin,p-mTOR)和mTOR表达。结果:TCGA数据提示UBE2O mRNA在胃癌组织中表达显著高于正常组织;免疫组化结果证实胃癌组织中UBE2O阳性表达率显著高于癌旁组织;UBE2O表达与肿瘤大小、浸润深度和TNM分期显著相关;干扰UBE2O显著抑制AGS和SGC-7901细胞增殖和侵袭;沉默UBE2O导致AGS和SGC-7901细胞中AMPKα2蛋白水平增加,而p-mTOR蛋白水平降低。结论:UBE2O在胃癌组织中表达上调并与恶性临床病理特征密切相关,UBE2O可能通过AMPKα2/mTOR信号通路促进胃癌细胞增殖和侵袭。

蛋白磷酸酶2A对机体能量代谢影响的研究进展

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是一种丝/苏氨酸磷酸酶,由A、B、C共3种亚基组成。研究显示,PP2A可通过催化蛋白质的去磷酸化反应,参与多种酶及转录因子的调控,在能量代谢、DNA损伤与修复、蛋白质翻译、细胞周期调控和信号转导等方面发挥重要作用。该文就PP2A的结构与调控、对能量代谢的影响以及在相关疾病发生中的作用进行综述。

应激诱导蛋白Sestrin2在多种病理过程中的作用研究进展

Sestrins是高度保守的应激诱导蛋白,可帮助维持代谢稳态并在应激条件下保护细胞。Sestrin2抑制氧化应激并调节AMP依赖的蛋白激酶-雷帕霉素靶点复合物(the AMP activated protein kinase-mammalian target of rapamycin complex,AMPK-mTORC)信号通路,在机体发生肿瘤、衰老退行性疾病、代谢性疾病、免疫性疾病时发挥保护作用。

mTORC2与心血管疾病的研究进展

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)是由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)为主要成分组成的复合体,mTOR是细胞生长和代谢的中央控制器,可调控细胞生长和代谢。mTORC2可通过作用于多个下游靶点调控多条信号通路,参与不同疾病的发生发展,在心血管疾病中具有重要作用。mTORC2参与自噬、免疫炎症、血管收缩以及线粒体稳态的调控,其表达下调可抑制代偿性肥厚,加速病理性心肌肥厚的发展;Rictor基因沉默以及mTORC2功能缺失导致心脏损害、寿命缩短甚至胚胎死亡;而在衰老过程中,激活mTORC2可诱导自噬并保持心脏功能。

激活mTORC2/Akt信号通路对6-羟基多巴胺模型小鼠多巴胺能神经元和行为学的影响

目的探讨激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)/Akt信号通路对6-羟基多巴胺(6-OHDA)模型小鼠多巴胺能神经元和行为学的影响及可能的机制。方法将36只体重20~25 g 3月龄Nestin-CreERTM::ROSA26-LacZ雄性C57BL/6J小鼠分为NS+玉米油组、6-OHDA+玉米油组、6-OHDA+PP242组、6-OHDA+A-443654组,并在小鼠右侧纹状体注射6-OHDA制备帕金森病(PD)小鼠模型以及每日腹腔注射mTORC2/Akt信号通路激动剂A-443654或抑制剂PP242。通过ELISA测定血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的水平;免疫组织化学和免疫荧光染色考察黑质(SN)-纹状体小胶质细胞、脑室周围神经前体细胞(NPCs)和多巴胺能神经元数目,Western blotting检测中脑水管mTORC2/Akt信号通路各相关蛋白Rictor,p-Akt和DNA损伤反应调节1(REDD1)的表达并通过免疫共沉淀验证它们之间的相互作用,最后观察各组小鼠行为学的变化。结果6-OHDA模型小鼠伴随小胶质细胞的激活和炎症因子的增加,黑质多巴胺能阳性神经元数目明显下降,小鼠的运动功能发生障碍,但NPCs数目较对照组小鼠明显增加,mTORC2/Akt信号通路相关蛋白表达也明显上调,在激动剂A-443654处理后随着相关蛋白的表达进一步上调,上述各指标均有明显改善,而抑制剂PP242处理组则呈现与激动剂A-443654完全相反的情况。结论A-443654通过上调mTORC2/Akt信号通路关键蛋白促进NPCs的增殖,增加新生多巴胺能神经元的数目并减少小胶质细胞的激活和炎症反应最终导致PD模型小鼠黑质-纹状体多巴胺能神经元和小鼠行为学的改善。