胃癌组织中雷帕霉素靶蛋白/70 ku核糖体蛋白S6激酶信号通路的表达及临床意义

目的 分析雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、70 ku核糖体蛋白S6激酶（P70S6K）的表达水平与胃癌常见临床病理因素的关系.方法 采用逆转录聚合酶链反应技术,蛋白质印迹技术（Western-blot）检测32例胃癌患者癌组织、癌旁胃组织以及22例非胃癌患者胃组织中磷酸化雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及磷酸化70 ku核酸体蛋白S6激酶（P70S6）K mRNA和蛋白水平的表达情况.结果 p-mTOR mRNA在胃癌组织中的表达水平（0.61±0.11）明显高于癌旁胃组织（0.43±0.10）及非胃癌胃组织（0.39 ±0.07）,p-P70S6KmRNA在胃癌组织中的表达水平（0.63 ±0.13）亦明显高于癌旁胃组织（0.45 ±0.14）及非胃癌胃组织（0.44±0.15）,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;mTOR mRNA和P70S6K mRNA在胃癌组织中的表达呈正相关（r=0.521,P=0.033）;Western-blot检测结果也证实p-mTOR及p-P70S6K在胃癌组织中的表达高于癌旁胃组织及非胃癌胃组织;mTOR及P70S6K mRNA在胃癌组织中的表达水平与病理分期、淋巴结转移等明显相关,而与肿瘤直径、性别等无明显关系.结论 mTOR/P70S6K信号通路在胃癌组织中过度表达可能是胃癌发生的重要机制之一.

电针对大鼠失神经腓肠肌中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/70KD核糖体蛋白S6激酶信号通路的影响

目的探讨电针延缓大鼠失神经骨骼肌萎缩的可能机制。方法雄性Sprague-Dawley大鼠18只随机分为假手术组(n=6)、模型组(n=6)和电针组(n=6)。后两组钳夹伤右侧坐骨神经制备失神经骨骼肌萎缩模型。造模后第2天,电针组电针右侧足三里穴和环跳穴,共2周。取双侧腓肠肌称重,计算腓肠肌湿重比;HE染色测量肌纤维横截面积和直径;Western blotting检测大鼠骨骼肌中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR (p-mTOR)、70KD核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)和磷酸化p70S6K (p-p70S6K)蛋白表达;实时定量聚合酶链反应检测大鼠骨骼肌中mTOR、p70S6K基因表达。结果与假手术组相比,模型组和电针组腓肠肌湿重比、肌纤维横截面积及直径显著下降(P<0.001),电针组明显高于模型组(P<0.01)。与假手术组相比,模型组右侧腓肠肌mTOR、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K蛋白表达升高(P<0.01);电针组高于模型组(P<0.05)。与假手术组相比,模型组右侧腓肠肌mTOR、p70S6K基因表达升高(P<0.05);电针组高于模型组(P<0.05)。结论电针可延缓失神经骨骼肌萎缩,可能与激活mTOR/p70S6K信号通路,影响骨骼肌蛋白合成有关。

间充质干细胞外泌体调节哺乳动物雷帕霉素靶点/p70核糖体蛋白S6激酶/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白通路改善糖尿病肾病大鼠肾损伤的机制研究

目的探讨间充质干细胞外泌体(MSC-EVs)通过调节哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(S6K1)/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白(Beclin 1)通路改善糖尿病肾病(DN)大鼠肾损伤的机制。方法采用高脂饮食联合腹腔链脲佐菌素(STZ)注射的方法建立SD大鼠DN模型,随机分为模型组、MSC-EVs组、MSC-EVs+MHY1485(mTOR激活剂)组,每组12只。另取12只SD大鼠以正常饲料喂养6周后,腹腔注射同等剂量柠檬酸钠溶液作为对照。以MSC-EVs和MHY1485分组处理后,检测大鼠血糖及肾功能指标[血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、尿微量白蛋白(UmALB)]水平。采用苏木精-伊红(HE)染色检测各组大鼠肾组织病理形态;采用免疫组化检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路相关蛋白表达;采用蛋白免疫印迹法检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路及自噬相关蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠肾组织形态发生损伤,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,MSC-EVs组大鼠肾组织形态损伤减轻,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著降低(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著升高(P<0.05);与MSC-EVs组相比,MSC-EVs+MHY1485组大鼠肾组织形态损伤加重,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05)。结论MSC-EVs可增强自噬,降低DN大鼠血糖、SCr、BUN和尿蛋白水平,减轻肾组织损伤,其机制可能与抑制mTOR/S6K1/Beclin 1通路激活有关。

鳖甲煎丸对肝癌大鼠黏着斑激酶/雷帕霉素靶蛋白通路的影响

目的:探讨鳖甲煎丸对肝癌模型大鼠肝组织病理特征及FAK/mTORC1通路的影响。方法:HepG2(1×10^(7))细胞注射于大鼠右腋皮下,建立肝癌模型,分为模型组、5-氟尿嘧啶组、鳖甲煎丸低剂量组、鳖甲煎丸高剂量组,另设正常组。各药物组给予相应药物灌胃,持续给药4周,正常组、模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液。实验结束后,测定肝癌组织重量、肝癌组织体积、肝癌组织抑瘤率、肝癌FAK、mTORC1水平、肝癌VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白水平。结果:与正常组比较,模型组肝癌组织重量、肝癌组织体积、肝癌组织抑瘤率、VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白、肝癌FAK、mTORC1 mRNA和蛋白表达升高(均P<0.05)。与模型组比较,5-氟尿嘧啶组、鳖甲煎丸低剂量组、鳖甲煎丸高剂量组肝癌组织重量、肝癌组织体积、肝癌组织抑瘤率、VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白、肝癌FAK、mTORC1 mRNA和蛋白表达降低(均P<0.05)。鳖甲煎丸高剂量组肝癌组织重量、肝癌组织体积、肝癌组织抑瘤率、VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白、肝癌FAK、mTORC1 mRNA和蛋白表达低于鳖甲煎丸低剂量组(均P<0.05)。结论:鳖甲煎丸对大鼠肝癌具有明显抑制作用,能减轻大鼠肝癌所致的病理损伤,其机制可能与鳖甲煎丸抑制肝癌FAK、mTORC1表达,诱导肝癌细胞凋亡,降低炎症反应有关。

肝细胞DEP结构域蛋白5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1信号轴在非酒精性脂肪肝形成中的作用

目的建立肝细胞Dishevelled/Egl-10/pleckstrin(DEP)结构域蛋白5(DEPDC5)基因(Depdc5)肝细胞特异性敲除小鼠高脂喂养模型,探讨DEPDC5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)信号轴对非酒精性脂肪肝的调控。方法构建肝细胞特异性敲除Depdc5^(flox/flox)模型;Alb-Cre小鼠(LKO),Depdc5^(flox/flox)小鼠(Loxp)作为对照。32只2~3月龄雄性小鼠随机分为高脂LKO组、高脂Loxp对照组、高脂+雷帕霉素LKO组及高脂+雷帕霉素Loxp对照组,每组8只。检测肝脏血清生物化学指标、脂质含量、蛋白、mRNA及病理切片,采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。结果高脂喂养导致LoxP小鼠肝脏脂肪变性,LKO小鼠肝脏脂肪变性减轻但合并出现肝损伤;雷帕霉素抑制了Depdc5敲除引起的mTORC1通路激活,显著改善Loxp小鼠肝脏脂肪变性,并改善LKO小鼠的肝损伤。结论Depdc5基因敲除能够保护高脂喂养小鼠肝脏脂肪变性,雷帕霉素可以改善DEPDC5缺失诱发的肝损伤。

罗哌卡因对骨肉瘤细胞增殖、侵袭及雷帕霉素靶蛋白/缺氧诱导因子1α信号通路的影响

目的:探究罗哌卡因对骨肉瘤细胞增殖、侵袭及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/缺氧诱导因子1α(HIF-1α)信号通路的影响。方法:将MG63细胞分为对照组、罗哌卡因低浓度组、罗哌卡因中浓度组、罗哌卡因高浓度组。采用平板克隆法测定MG63细胞平板克隆率,采用免疫组化法测定MG63细胞Ki-67表达,采用Transwell法测定MG63细胞侵袭、迁移能力,采用Western blot法测定MG63细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、mTOR、HIF-1α蛋白表达。结果:与对照组比较,罗哌卡因低、中、高浓度组MG63细胞克隆形成率、Ki-67阳性率、侵袭细胞数、迁移细胞数以及MMP-2、MMP-9、mTOR、HIF-1α蛋白表达降低(均P<0.05)。与罗哌卡因低浓度组比较,罗哌卡因中、高浓度组MG63细胞克隆形成率、Ki-67阳性率、侵袭细胞数、迁移细胞数以及MMP-2、MMP-9、mTOR、HIF-1α蛋白表达降低(均P<0.05)。与罗哌卡因中浓度组比较,罗哌卡因高浓度组MG63细胞克隆形成率、Ki-67阳性率、侵袭细胞数、迁移细胞数以及MMP-2、MMP-9、mTOR、HIF-1α蛋白表达降低(均P<0.05)。结论:罗哌卡因可抑制MG63细胞增殖、侵袭、迁移,并可抑制mTOR/HIF-1α通路的激活。

甘草苷对口腔鳞状细胞癌细胞磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路的影响

目的 探讨甘草苷对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(MTOR)信号通路的影响。方法 提取114例OSCC患者的肿瘤细胞进行体外培养,调整细胞状态至对数生长期备用。采用CCK8法检测不同浓度(0、10、20、30、40μmol/L)甘草苷提取液对对数生长期的OSCC细胞存活率的影响;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测OSCC细胞中PI3K、AKT、MTOR蛋白的相对表达量;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PI3K、AKT、MTOR mRNA的相对表达量。结果 随着甘草苷提取液浓度的逐渐增加,OSCC细胞存活率逐渐下降,PI3K、AKT、MTOR蛋白及mRNA相对表达量均逐渐下降(P﹤0.05)。结论 甘草苷可能通过抑制OSCC细胞PI3K、AKT、MTOR蛋白及mRNA的表达抑制OSCC细胞生长,进而对OSCC产生抑制效果。

EC9706和Eca109细胞中雷帕霉素靶蛋白信号通路激活状态观察

目的:观察低分化的食管鳞癌细胞EC9706和高分化的食管鳞癌细胞Eca109中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号转导通路的激活状态。方法:采用细胞免疫组织化学方法检测EC9706和Eca109细胞中mTOR及其下游靶分子p70S6K的表达和定位,并采用RT-PCR和Westernblot方法分别从mRNA及蛋白水平检测此通路的活性。结果:在2种细胞中mTOR均有表达,且在EC9706细胞中的表达水平高于Eca109(P<0.05);EC9706细胞中mTOR下游靶点的磷酸化水平高于Eca109细胞(P<0.05)。结论:在2种食管鳞癌细胞中,mTOR信号通路均特异性激活;但激活状态与细胞的分化程度有关,细胞分化程度低者通路的激活水平较高。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂在器官移植受者病毒感染中的作用

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂是目前器官移植受者术后常用的免疫抑制药,主要包括西罗莫司(雷帕霉素)和依维莫司。mTOR抑制剂除通过抑制T细胞增殖达到免疫抑制作用外,还具有抗衰老、抗肿瘤、抗病毒感染等多种潜在作用。病毒感染是器官移植术后最常见并发症之一,目前抗病毒治疗的方法较为有限且疗效欠佳。本文对mTOR通路在病毒感染中的作用、常见mTOR抑制剂的作用机制及mTOR抑制剂在不同病毒感染中的作用进行综述,旨为mTOR抑制剂在器官移植受者的临床应用及后续研究提供参考。

雷帕霉素靶蛋白调节自噬在理筋手法改善静力性损伤中的作用机制研究

目的通过观察理筋手法对兔颈后肌静力性损伤的干预,观察家兔一般状况、组织形态学、超微结构、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)及自噬相关蛋白Bcl-2-腺病毒E1B相互作用蛋白3(bcl-2-adenoirus E1B 19-Kda interacting protein 3,BNIP3)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1-light chain 3,LC3)、核孔蛋白62(nucleoporin 62,P62)的变化,探索mTOR分子抑制骨骼肌过度自噬的相关机制。方法选择日本大耳兔40只,按随机数字表选取5只作为空白对照组,其余均采用颈椎前屈位45°固定,每日5小时,建立颈部慢性静力性损伤模型。60天后随机选取5只与空白组对照,通过一般行为学和组织形态学验证造模是否成功。剩余30只随机分为模型组和手法治疗组,每组各15只,模型组不予任何治疗,治疗组每日予以松筋、拨筋、顺筋三种手法治疗,力量控制为2 kg,频率100次/分钟,持续5分钟,分别在第10天、20天、30天各处死5只进行颈后肌取材。采用苏木素—伊红染色(HE染色)及透射电镜观察骨骼肌组织形态学和超微结构变化。采用蛋白免疫印迹法检测mTOR及自噬相关因子LC3、BNIP3、P62的蛋白表达变化,实时荧光定量法检测BNIP3、P62 mRNA水平的变化。结果家兔造模结束后出现精神萎靡不振,但触及颈部时反应敏捷易躲闪,颈部可触及条索状物。与空白组比较,模型组HE染色见肌纤维排列紊乱,扭曲变形,大量炎性物质浸润,10天、20天、30天时肌纤维扭曲程度逐渐减轻,排列较整齐,炎性细胞逐渐减少,且治疗组效果优于模型组。透射电镜下与空白组比较,模型组可见肌丝严重扭曲变形,肌节模糊,线粒体肿胀散乱分布。10天、20天、30天时肌丝扭曲程度逐渐减轻,肌节逐步完整,线粒体形态趋于正常,数量逐渐增多,且各治疗组效果优于模型组。蛋白免疫印迹法结果显示,与空白组比较,模型组P-mTOR、BNIP3和LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达量升高(P<0.05),P62蛋白表达量降低(P<0.05);与同一时间点模型组比较,各治疗组P-mTOR表达量升高(P<0.05),BNIP3蛋白表达量降低(P<0.05),治疗10天组和治疗20天组P62表达量均升高(P<0.05),LC3Ⅱ/Ⅰ表达量均下降(P<0.05)。实时荧光定量法结果显示,与空白组比较,模型组BNIP3 mRNA水平升高(P<0.05),P62 mRNA水平降低(P﹤0.05);与同一时间点模型组相比,治疗组BNIP3 mRNA水平下降(P<0.05)。结论家兔颈部前屈造成颈后肌静力性损伤后,自噬被激活,理筋手法干预后自噬水平逐渐下降,可能与理筋手法作用于mTOR信号通路调节自噬有关,从而维持细胞内环境的稳态,促进肌肉组织的修复。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白自噬通路在支气管肺发育不良中的作用

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)自噬通路在支气管肺发育不良中的作用。方法将A549细胞(腺癌人类肺泡基底上皮细胞)一定条件培养后分成对照组、支气管肺发育不良组、雷帕霉素干预组。支气管肺发育不良组、雷帕霉素干预组高氧环境培养,置于37℃、85%氧气孵化箱中培养48 h,前者不加药剂、后者加10μmol/L的雷帕霉素干预;对照组常规环境培养,置于37℃、5%二氧化碳孵化箱中培养48 h,不加药剂。利用高氧构建支气管肺发育不良的细胞模型,利用蛋白质印迹实验和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)实验验证自噬对高氧处理后A549细胞肺泡表面标志物合成蛋白复合物(SPC)、水通道蛋白5(AQP5)的影响,利用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)实验检测自噬对高氧处理后A549细胞增殖的影响,利用蛋白质印迹实验验证PI3K/Akt/mTOR自噬通路在支气管肺发育不良中的作用。结果蛋白质印迹实验和RT-qPCR实验表明自噬激活剂雷帕霉素挽救了高氧处理后A549细胞SPC、AQP5表达的下调。EdU实验表明雷帕霉素显著促进了高氧处理后A549细胞的增殖,EdU阳性细胞百分比高于支气管肺发育不良组[(0.48±0.06)比(0.36±0.02)](P<0.05)。蛋白质印迹实验显示雷帕霉素干预后的A549细胞中的磷酸化-PI3K、磷酸化-Akt、磷酸化-mTOR、自噬选择性底物P62的表达水平显著降低,微管相关蛋白1轻链3的表达水平显著上升(均P<0.05)。结论PI3K/Akt/mTOR自噬通路在支气管肺发育不良中发挥着重要作用。

植物雷帕霉素靶蛋白激酶研究进展

植物雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,TOR)作为信号和代谢调节中枢,通过磷酸化修饰整合营养、能量和环境信号,感知植物体内能量变化,调节植物生长发育和环境适应过程。在本文中,我们回顾了TOR的发现历程,总结了以往和近期植物TOR的信号通路研究进展(包括新发现的部分上游效应因子和下游调控路径),TOR在植物胚胎发生、分生组织形成、养分利用、开花和衰老等不同生长发育阶段或代谢过程中的重要作用,以及响应非生物胁迫和生物胁迫的生物学机制,还展望了TOR激酶在未来的研究热点方向及其在农业生产中的应用。

丝/苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/p70 S6K信号通路在口腔鳞癌中的表达及临床意义

目的探讨丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70 S6K信号通路在口腔鳞癌组织中的表达情况,为口腔鳞癌的早期诊断和治疗提供参考。方法收集口腔鳞癌标本51例,癌旁黏膜组织10例,正常口腔黏膜10例。采用免疫组织化学SP法检测口腔鳞癌、癌旁黏膜组织及正常口腔黏膜中p-Akt、p-mTOR及p70S6K的表达情况,分析三者相互之间表达的相关性。结果 p-Akt、p-mTOR及p70 S6K在口腔鳞癌组中的表达显著高于正常口腔黏膜组和癌旁黏膜组的表达。p-Akt、p-mTOR及p70 S6K在口腔鳞癌的表达与患者的年龄、性别及临床分期无相关性,但与口腔鳞癌的分化程度及有无淋巴结转移有相关性。p-Akt、p-mTOR及p70 S6K在口腔鳞癌的表达相互之间具有较强的正相关关系。结论 Akt/mTOR/p70 S6K信号通路分子在口腔鳞癌中表达活跃,提示可能与口腔鳞癌的发生发展具有重要的相关性。

哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白及其底物在口腔鳞状细胞癌中的表达

目的 探讨哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白 (mTOR)及其底物对口腔鳞状细胞癌生长的影响。方法 提取RNA ,通过RT_PCR和Western印迹分析观察mTOR及其底物p70S6激酶 (p70S6k)的α1 、α2 、β1 、β2 不同亚型及起始因子 4E结合蛋白 1(4EBP1)在口腔鳞状细胞癌中的表达。结果 RT_PCR与Western印迹的结果一致。随着肿瘤恶性度的提高 ,mTOR、p70S6K的表达明显增加 ,而 4EBP1的表达则下降。结论 mTOR及其底物表达水平的强弱与口腔鳞状细胞癌的分化程度密切相关 ,它可能成为未来癌症治疗的重要靶向蛋白。

雷帕霉素靶蛋白的蛋白信号通路及其与代谢性疾病相关性

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyoin,mTOR)是进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(plosphatidylinositol 3-kinase-related kinase,PIKK)蛋白质家族的成员。mTOR作为细胞生长的核心因子,与不同的蛋白质结合时表现出不同的生理功能,参与基因转录、蛋白质翻译起始、核糖体生物合成、细胞周期调控、DNA损伤修复、重组和端粒酶长度的维持等。PIKK家族激酶的功能异常会导致多种代谢性疾病。通过对不同的mTOR相关蛋白信号转导机制的研究,进一步探讨代谢综合征的发病机制,并为相关治疗提供分子靶标。

脊髓哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路参与大鼠外周神经损伤诱发的痛觉过敏

目的:探讨哺乳动物雷帕霉素(rapamycin,RAPA)靶蛋白(mammalian target of RAPA,m TOR)信号通路是否通过激活脊髓背角星形胶质细胞参与外周神经损伤诱发的大鼠痛觉过敏。方法:取健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,随机分为6组(n=5):1 d组(D1组)、4 d组(D4组)、7 d组(D7组)、14 d组(D14组)、正常组、假手术组。其中D1,D4,D7,D14组建立坐骨神经慢性压榨损伤(chronic constriction injury,CCI)模型,Normal组不做处理,Sham组仅暴露坐骨神经。于CCI术后第1,4,7,14天分别测定各组大鼠左后肢机械缩足阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)和热缩足潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)。D1,D4,D7,D14组分别于CCI术后第1,4,7,14天,假手术组和正常组于相应第14天采集腰段脊髓。采用免疫组织化学法观察m TOR在大鼠脊髓的分布,采用real-time PCR和蛋白质印迹法检测CCI大鼠腰段脊髓m TOR mRNA和蛋白的表达。另取雄性SD大鼠30只,完成鞘内置管后,随机分为6组(n=5):空白组、CCI组、早给药组(CCI+early RAPA组)、早溶剂组[CCI+early二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)组]、晚给药组(CCI+later RAPA组)、晚溶剂组(CCI+later DMSO组)。空白组不建立CCI模型也不给药;CCI组建立左后肢CCI模型;CCI+early RAPA组于CCI术后4 h开始鞘内注射1%RAPA 10μL,连续给药3 d;CCI+early DMSO组于CCI术后4 h开始鞘内注射同浓度等体积溶剂4%DMSO 10μL作为对照;CCI+later RAPA组于CCI术后第7天开始鞘内注射1%RAPA 10μL,连续给药3 d;CCI+later DMSO组于CCI术后第7天开始鞘内注射同浓度等体积溶剂DMSO10μL作为对照。各组于鞘内置管前后以及CCI术后隔天测定痛阈。于CCI术后第14天取腰段脊髓,免疫组织化学检测脊髓背角胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达。结果:m TOR免疫组织化学阳性颗粒广泛分布于正常脊髓神经元胞浆中;D14组大鼠术后第1,4,7,14天的PWMT与其基础值比较明显降低,术后第4,7,14天的PWTL与其基础值比较明显降低(P<0.05或P<0.01);与正常组比较,CCI组(D1,D4,D7和D14组)大鼠腰段脊髓m TOR的mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.05或P<0.01);与CCI+early DMSO组相同时间点比较,CCI+early RAPA组CCI术后第4,6,8,10,12,14天的PWMT和PWTL均升高(P<0.05或P<0.01);与CCI+later DMSO组相同时间点比较,CCI+later RAPA组CCI术后第8,10,12,14天的PWMT和PWTL均升高(P<0.05或P<0.01);CCI+early RAPA组与CCI+early DMSO组、CCI+later RAPA组与CCI+later DMSO组相比较,CCI大鼠术侧腰段脊髓背角GFAP免疫组织化学阳性面积与吸光度值均下降(均P<0.05或P<0.01)。结论:脊髓m TOR信号通路可能通过脊髓背角星形胶质细胞活化参与外周神经损伤诱发的痛觉过敏。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种Ser/Thr激酶,属于PIKK超家族,对调节细胞周期、蛋白质合成等具有重要作用,是细胞生长、增殖、分化、凋亡的中心调控器,但在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道.以小鼠卵母细胞为研究对象,采用免疫荧光为主要研究方法,对mTOR在小鼠卵母细胞中的表达进行研究,并通过mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对卵母细胞进行处理,对mTOR在卵母细胞成熟过程中的作用进行研究.结果显示:小鼠卵母细胞成熟过程中,生发泡(germinal vesicle,GV)期mTOR主要集中在核膜处表达,生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)后mTOR伴随染色体分布,第二次减数分裂中期(second metaphase,MⅡ期)mTOR伴随纺锤体分布;雷帕霉素处理后,小鼠卵母细胞的成熟受到抑制,且这种抑制作用具有浓度依赖性,同时其mTOR的表达部位和形态也发生变化.研究表明,在小鼠卵母细胞成熟过程中,mTOR在各个时期的表达及分布具有阶段特异性,并对小鼠卵母细胞GVBD的发生和第一极体的排放都具有重要作用.

白藜芦醇通过调控雷帕霉素靶蛋白/M2型丙酮酸激酶轴抑制口腔鳞状细胞癌细胞的糖酵解作用

目的:通过雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/M2型丙酮酸激酶(M2 isoform pyruvate kinase,PKM2)轴探讨白藜芦醇对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞的糖酵解的影响。方法:培养CAL-27和SCC-15细胞,采用不同浓度白藜芦醇(0、50、100、200、400、800 μmol/L)分别处理细胞24 h,噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测其对细胞增殖的影响并计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC 50 )值。选用250 μmol/L白藜芦醇或10 nmol/L mTOR抑制剂Rapamycin干预细胞 24 h ,采用2-脱氧葡萄糖类似物[(2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose,2-NBDG]法检测细胞葡萄糖摄取率;比色法检测细胞上清中乳酸含量、细胞内糖酵解关键酶己糖激酶(hexokinase,HK)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)活性;Western blot检测细胞中己糖激酶2(hexokinase2,HK2)、PKM2、mTOR和磷酸化mTOR(phosphorylation mTOR,p-mTOR)等蛋白表达情况。结果:白藜芦醇对两株OSCC细胞的增殖有明显的抑制作用( P <0.05),并呈现浓度依赖性。白藜芦醇可显著抑制两株OSCC细胞的葡萄糖摄取能力以及降低乳酸的产生量( P <0.05),并可抑制两株细胞PK活性( P <0.05)、下调PKM2蛋白的表达( P <0.05),但对HK活性及HK2蛋白的表达无显著影响( P >0.05)。同时,白藜芦醇干预还可显著降低细胞内p-mTOR水平( P <0.05)。另外,Rapamycin干预也可抑制两株细胞的葡萄糖摄取能力、降低细胞上清中乳酸的产生量和细胞内p-mTOR水平,同时也可下调PKM2蛋白的表达。结论:白藜芦醇可抑制OSCC细胞的糖酵解作用,其机制可能与抑制mTOR/PKM2轴通路相关。

雷帕霉素靶蛋白信号通路在食管癌细胞系中激活状态的研究

[目的]研究雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导通路在食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109中的激活状态。[方法]采用细胞免疫组化检测mTOR及其下游靶分子(p70S6K)在两细胞系中的表达,并采用RT-PCR和Westernblot方法分别从mRNA水平及蛋白水平测定此通路的活性。[结果]mTOR在两种细胞系中均有表达,且在EC9706中的表达水平明显高于Eca109,mTOR下游靶点(p706S6K)的磷酸化水平也是EC9706明显高。[结论]mTOR信号通路在两种细胞系中都是特异性激活。激活状态与细胞的分化程度有关,细胞分化程度越低,通路的激活水平越高。

腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路介导能量和必需氨基酸调控乳蛋白合成

乳蛋白合成是以必需氨基酸为底物的耗能过程。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是AMPK信号通路的重要分子;可通过感受细胞能量状态的方式来维持能量平衡,从而为乳蛋白合成提供充足的能量。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)是AMPK信号通路重要的下游靶点;必需氨基酸主要以m TOR介导的信号通路调控乳蛋白合成。本文主要综述了能量和必需氨基酸通过AMPK/m TOR信号通路对乳蛋白合成调控的研究进展,旨在进一步阐明能量和必需氨基酸对乳蛋白合成调控的作用机理。