灵雷菌质的急性毒性实验研究

研究双向性固体发酵后灵雷菌质的急性毒性。用双向性固体发酵技术获得灵雷菌质,用Bliss法计算小鼠的半数致死量(LD5)0。结果表明各灵雷菌质组的LD50均高于雷公藤生药组,尤以3G30组最高。双向性固体发酵技术可降低雷公藤的急性毒性。

灵雷菌质提取物体内抗肿瘤作用的实验研究

采用小鼠肉瘤(S180)移植性肿瘤模型,观察灵雷菌质乙酸乙酯部位、正丁醇部位、石油醚部位和水部位提取物的肿瘤抑制作用,并测定小鼠的胸腺指数及脾脏指数。结果表明所有的提取物都呈现出明显的抑瘤效果,抑瘤率均大于35%,其中部分正丁醇部位的抑瘤率达到了68.88%。抑瘤效果由弱至强的顺序为石油醚部位<水部位<乙酸乙酯部位<正丁醇部位,而胸腺指数与脾脏指数则显示只有乙酸乙酯部位组有较明显的免疫抑制效果。双向性固体发酵可降低雷公藤的毒性,尤其正丁醇部位和水部位的毒性可能较弱。

灵雷菌质抗炎镇痛作用的研究

目的考察灵雷菌质的抗炎镇痛作用。方法通过二甲苯致耳肿胀及醋酸引起毛细血管扩张法观察灵雷菌质的抗炎作用;采用热板法观察灵雷菌质的镇痛作用。结果灵雷菌质对二甲苯所致小鼠耳肿胀和醋酸引起的毛细血管扩张有良好的抑制作用;并能提高热致痛小鼠的痛阈。结论双向固体发酵后的灵雷菌质仍保留一定的抗炎与镇痛作用。

4种植物叶提取液对青枯雷尔氏菌抑菌活性研究

青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum是一种毁灭性土传病害病原菌,防治困难,通过抑菌圈、抑菌率、最小抑菌浓度测定,探讨羊蹄甲、三裂蟛蜞菊、马缨丹、芒果叶提取液对青枯菌的抑制效果。结果表明:三裂蟛蜞菊叶提取液的抑菌效果最好,抑菌圈范围为15.00~18.13 mm,为高度敏感,在0.40 g·mL-1浓度处理下,其抑菌率达到79.63%,显著高于其他处理组;羊蹄甲和马缨丹叶提取液的抑菌圈范围为10.67~15.57 mm,为中度敏感,抑菌率分别为58.33%和60.37%;芒果叶提取液的抑菌效果最差。

拮抗青枯雷尔氏菌的放线菌筛选及其防病作用

【目的】青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是烟草的主要病害。本研究从不同生境的土壤中筛选出对青枯雷尔氏菌有较强拮抗作用的放线菌,探究其对青枯雷尔氏菌的生理特征影响以及对烟草青枯病的防治效果,为进一步开发防病微生物菌剂提供理论依据。【方法】利用共培养法和牛津杯法筛出目标放线菌后,通过形态学研究、生理生化试验和多基因系统发育分析对目标菌株进行菌种鉴定。通过96孔板法测定目标放线菌粗浸膏对青枯雷尔氏菌的最低抑菌浓度(MIC)。粗浸膏对青枯雷尔氏菌处理后,检测青枯雷尔氏菌的生长动态变化,并用扫描电子显微镜观察其形态的变化;通过测定β-半乳糖苷酶活性和碘化丙啶(PI)荧光试验以及傅里叶变换红外光谱观察对细胞膜通透性和膜成分的影响;通过测定胞外多糖(EPS)、胞内活性氧(ROS)等探究目标放线菌株对青枯雷尔氏菌的影响。并通过盆栽试验测定目标放线菌株对烟草青枯病的防治效果。【结果】根据形态特征、生理生化试验结果和测序结果,将筛选得到的目标放线菌Sa-21菌株鉴定为雷帕链霉菌(Streptomyces rapamycinicus),对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径达47.9 mm。Sa-21菌株粗浸膏抑制青枯雷尔氏菌的最低抑菌浓度为0.5μg·mL^(-1),对菌体增殖也有明显的抑制作用,并且试验范围内随着粗浸膏浓度的升高抑制作用增强。扫描电子显微镜观察到粗浸膏处理后的青枯雷尔氏菌菌体结构发生改变,导致菌体出现穿孔和皱缩等现象,试验范围内随着粗浸膏浓度的升高,破裂菌体数量增加,皱缩程度增强,并且粗浸膏处理后,碘化丙啶可以穿过细胞膜与胞内物质结合发出荧光,且β-半乳糖苷酶活性显著增加,说明处理后的青枯雷尔氏菌细胞膜通透性提高。进一步研究发现,粗浸膏处理可导致青枯雷尔氏菌胞内活性氧积累,胞外多糖产量下降,说明对细胞膜造成了一定程度的损伤。盆栽防病试验表明,先接种病原菌后喷施发酵滤液10倍稀释液的处理对烟草青枯病的相对防治效果为67.61%,而先喷施发酵滤液10倍稀释液再接种的处理对烟草青枯病的相对防治效果为85.89%。【结论】链霉菌Sa-21能抑制青枯雷尔氏菌菌体增殖、破坏细胞膜结构,对烟草青枯病有较好的防治效果,具有一定的开发潜力和应用价值。

华南地区茄科作物青枯病发生与病原菌分布特性分析

调查我国华南地区番茄、茄子和辣椒等茄科作物青枯病害发病情况,采集健康植株和青枯病发病株及其根际土壤样本,进行病原菌的分离鉴定、致病力测定和分布特性分析。结果表明:番茄、茄子和辣椒发病率最高的地区分别是海南陵水、福建晋安和福建邵武,其生育期内平均发病率分别达20.01%、5.24%和23.33%。从不同地理来源的茄科作物中,共分离鉴定出86株青枯菌。进一步利用弱化指数(Attenuation index,AI)对分离的青枯菌进行致病力划分,其中7株为无致病力菌株(AI>0.75),13株为过渡型菌株(0.65≤AI≤0.75),66株为强致病力菌株(AI<0.65)。研究青枯菌的分布特性发现,对于不同寄主,青枯菌分布特性均是病株及其根际土壤分布数量显著多于健康植株及其根际土壤,且分布数量均是土>根>茎,此外,调查的茄科作物中,青枯病发病株土壤青枯菌分布数量均大于106 cfu·g^(-1),青枯病发病株根和茎青枯菌分布数量均大于105 cfu·g^(-1)。

青枯雷尔氏菌温度相关致病基因yqhE功能研究

不同温度下青枯雷尔氏菌表达谱PPI网络分析发现,yqhE可能是青枯雷尔氏菌新的温度相关致病基因。克隆青枯雷尔氏菌CBM613的yqh E基因,结果发现该基因长度为831 bp,共编码276个氨基酸。基因敲除结果显示,28℃培养的yqhE突变株较野生型菌株致病力降低,病程延长,但并未彻底丧失致病力。20℃和28℃培养的yqh E突变株维生素C的生物合成皆被抑制;与28℃相比,20℃培养下野生型菌株维生素C的合成能力降低。突变株在20℃和28℃培养下甲基乙二醛(MG)和丙二醛(MDA)明显积累,其中20℃积累更多;20℃培养的野生型菌株MG和MDA比28℃积累更多。维生素C的生物合成被抑制导致青枯雷尔氏菌自由基清除能力减弱与氧化应激反应增强,MG和MDA积累产生细胞毒性,上述结果可能与28℃培养的突变株致病力减弱,20℃培养的野生型菌株致病力丧失有关。综上结果表明yqhE是青枯雷尔氏菌温度相关致病基因。

灵雷菌质对大鼠的肝脏毒性及对Nrf2蛋白表达的影响

目的研究雷公藤固体发酵产物灵雷菌质的肝脏毒性。方法 SD大鼠随机分为对照组、灵雷菌质组、雷公藤组,灵雷菌质组及雷公藤组分别ig给予灵雷菌质、雷公藤95%乙醇提取物2.037 5、0.64 g/kg,每日给药1次,连续给药30 d。给药结束后检测大鼠血液生化指标,观察大鼠肝组织病理学改变,Western blotting检测大鼠肝组织中Nrf2、P38蛋白表达。结果肝组织病理学观察可见,灵雷菌质组大鼠肝组织仅见中央细胞坏死,周边细胞局部胞质溶解,出现细胞凋亡;雷公藤组肝组织可见小片状坏死,核凋亡,肝细胞内胶原纤维明显,细胞溶解坏死。与对照组相比,灵雷菌质组、雷公藤组大鼠丙氨酸转氨酶(ALT)水平、核蛋白Nrf2和总蛋白P38表达升高,但灵雷菌质组的上述指标比雷公藤组显著下降(P<0.05)。与对照组相比,灵雷菌质组、雷公藤组大鼠白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)均下降(P<0.05),而灵雷菌质组ALB、TP下降幅度较雷公藤组小(P<0.05)。结论灵雷菌质的肝脏毒性较雷公藤低,其毒性机制可能与激活P38 MARK和Nrf2-ARE信号通路、启动抗氧化作用有关。

复合微生物菌剂对灵芝菌、青枯雷尔氏菌的抑菌对比研究

【目的】对比复合微生物菌剂对灵芝菌、青枯雷尔氏菌的抑菌效果,为开展有效防治植物的灵芝根腐病和青枯病提供参考。【方法】从凤凰木上分离获得2株灵芝菌,购买青枯雷尔氏菌,分别在PDA、SPA培养基上加入复合微生物菌剂进行培养,以无复合微生物菌剂培养的菌株为对照,观察抑菌效果。【结果】复合微生物菌剂对灵芝菌的抑菌圈直径为0.50和0.67 cm,平均抑菌率为97.69%,对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径为2.50、2.70和2.90cm,平均抑菌率为30.00%。【结论】复合微生物菌剂对真菌类的凤凰木根腐病灵芝菌抑菌率在95.37%~100.00%,生防效果好;对细菌类的青枯雷尔氏菌的抑制作用差。

番茄青枯病病原菌生物学特性及致病机制研究进展

由青枯雷尔氏菌引起的青枯病给番茄产业发展带来了严重挑战,青枯病的侵染造成番茄产量和质量严重受损。在总结番茄青枯病病原菌生物学特性的基础上,分析了番茄青枯病病原菌的致病机理及其对作物产量和质量的危害,阐述了青枯菌的致病效应蛋白,提出了番茄青枯病生物防治方法,以期为全面了解和有效防治番茄青枯病提供参考。

灵雷菌质对阿霉素诱导大鼠肾病模型的作用

目的考察灵芝双向固体发酵雷公藤得到的灵雷菌质(G30)对阿霉素诱导的大鼠肾病模型的作用。方法尾iv阿霉素6.5mg/kg复制大鼠肾病模型,分别给予不同剂量的G30、雷公藤生药、灭菌生药(灭菌药)及雷公藤多苷两周,检测大鼠体质量、24h尿蛋白量、血清总蛋白(TP)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等生化指标。结果与模型组比较,G30增加肾病大鼠体质量,降低24h尿蛋白、血清TG、TC量,同时升高血清TP水平(P<0.05);与生药组比较:G30降低肾病大鼠24h尿蛋白、血清BUN、SCr,同时使血清CK、ALT量保持正常水平,光镜下显示G30减轻了肾病大鼠的肾小球充血及空泡样变性等病理变化。结论 G30对阿霉素诱导的肾病有一定的治疗作用,与雷公藤生药比较毒性低、效果好。

灵雷菌质对大鼠类风湿性关节炎作用的实验研究

目的考察灵雷菌质对佐剂型类风湿性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠的治疗作用。方法建立弗氏完全佐剂(Fre-und’s complete adjuvant,CFA)诱导的大鼠类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)模型,将大鼠分为空白组、灵雷菌质高剂量给药组、灵雷菌质低剂量给药组、雷公藤多苷片给药组、模型组,连续灌胃给药2周后,检测各组大鼠的体重、关节肿胀度、关节炎指数、关节病理变化、血清肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β。结果灵雷菌质能改善大鼠一般状况并提高AA大鼠体重,缓解AA大鼠关节红肿程度,降低其关节炎指数,改善RA大鼠的关节病理变化,显著抑制TNF-α和IL-1β的表达。结论灵雷菌质对佐剂型关节炎有一定的治疗作用。

青枯雷尔氏菌在植株体内分布及其致病力的异质性研究

【目的】通过分析青枯雷尔氏菌在不同寄主发病植株、在同一寄主不同侵染状态植株和同一寄主不同发病阶段植株体内分布及其致病力的异质性,从生态位角度来初步探讨该病原菌与植物之间的相互关系。【方法】采用田间采样,室内测定样本的含菌量及其病原菌的致病性(弱化指数),统计分析比较青枯雷尔氏菌在寄主植株体内的分布和致病力的异质性。【结果】番茄和茄子病株体内青枯雷尔氏菌的平均含菌量>100×108cfu/g,显著高于烟草、花生和生姜(<70×108cfu/g)。青枯雷尔氏菌的分布在番茄体内依次为根部>中部以上茎>中部以下茎;茄子和花生从根到上部茎依次含菌量逐渐降低;烟草根部和中部茎的含菌量显著高于下部和上部茎;生姜下部茎的含菌量显著高于姜块和中上部茎。不同寄主植物植株体内青枯雷尔氏菌的致病性差异显著,根据弱化指数的划分标准,平均弱化指数的大小依次为茄子>烟草>花生>番茄>生姜;生姜体内的青枯雷尔氏菌的平均弱化指数为0.49(<0.60),明显表现为强致病力,茄子体内的为0.80,接近于无致病力,烟草、花生和番茄为0.64～0.70,属于致病力不确定的菌株。茄子、生姜和花生的健康和发病植株检测的结果表明,仅有花生的健康与发病植株同时存在着青枯雷尔氏菌,而茄子和生姜健株无青枯雷尔氏菌侵染。【结论】青枯雷尔氏菌在不同寄主、不同发病状态、不同生育期植株体内的分布及致病力呈现明显的生态位分化的特征,了解这一特性对于青枯雷尔氏菌控制具有重要意义。

福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究

【目的】利用气相色谱技术检测福建省的40株青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)菌株细胞内的脂肪酸,分析其脂肪酸分布的多态性;研究青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与青枯雷尔氏菌现有种下分化方法之间的关系。【方法】对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行气相色谱分析,比较同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌脂肪酸的分布;对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行聚类分析,分析聚成的各类青枯雷尔氏菌脂肪酸的特点以及脂肪酸多态性与其生理小种、生化型和致病性之间的关系。【结果】同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌,其脂肪酸都存在着明显的多态性;对40株青枯雷尔氏菌的脂肪酸进行聚类分析,可以聚成3类,即groupⅠ、groupⅡ和groupⅢ;青枯雷尔氏菌生理小种1存在着不同的脂肪酸类群,青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与其生化型之间不存在相关性,但是脂肪酸和致病性之间存在一定的相关性:groupⅠ为无致病性菌株,groupⅡ为过渡性菌株,groupⅢ为强致病性菌株。【结论】福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸分布存在着明显的多态性;青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与致病性之间存在一定的相关性,脂肪酸有望成为青枯雷尔氏菌小种鉴定的新指标。

一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体的分离及生物学特性分析

【目的】分离并纯化出一株裂解性青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)噬菌体,并测定其各项生物学特性,为开发新的抗烟草青枯病制剂提供依据。【方法】取烟草青枯病重病田中健康烟株的根际土壤制成土壤悬浮液,并通过在青枯雷尔氏菌菌液中加入过滤后的土壤悬浮液富集噬菌体,用双层平板法验证噬菌体的存在后挑取单个最大噬菌斑进行反复纯化,直到得到单一清晰的噬菌斑。纯化后的单个噬菌斑加入对数早期的青枯雷尔氏菌菌液中进行增殖培养,将增殖液按常规方法进行噬菌体颗粒浓缩后,取20μL浓缩液用磷钨酸染色并通过电子显微镜观察噬菌体的形态特征;同时将浓缩液进行SDS-PAGE电泳,观察蛋白条带大小和数量;用λ噬菌体DNA提取试剂盒提取噬菌体增殖液中的噬菌体核酸进行琼脂糖凝胶电泳,确定其基因组片段大小;最后用常规方法测定噬菌体的滴度、最佳感染复数、一步生长曲线,并通过比较加入噬菌体液前后青枯雷尔氏菌菌液的OD600值变化测定其对温度、p H、紫外线、氯仿的敏感性。【结果】分离并纯化出了一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体,命名为∈RS-1,噬菌斑为圆形,清晰透明,边缘光滑,直径1—2 mm,经电镜观察其形态为蝌蚪状,头部为二十面体的立体对称,直径约为94 nm,并有一带伸缩尾鞘的长尾大约为27 nm×100 nm,按照国际病毒分类委员会分类标准,其属于有尾噬菌体目(Caudovirales),肌尾噬菌体科(Myoviridae)的裂解性噬菌体,核酸性质为ds DNA;噬菌体浓缩液经SDS-PAGE分析至少可以观察到25条蛋白条带,相对分子质量在10—100 k D,说明其蛋白外壳至少含有25个结构蛋白;将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳显示其条带大于48 kb,符合肌尾噬菌体科基因组大小范围(31—317 kb);生物学特性的测定显示该噬菌体对青枯雷尔氏菌的最佳感染复数为0.01;其吸附和感染青枯雷尔氏菌时的潜伏期约为30 min,爆发期约为80 min,裂解量约为156;该噬菌体的裂解活性在28℃时最高,在28—50℃均较强,但在温度超过60℃后活性基本丧失;其对酸碱的耐受力较强,在p H 3—8的范围内均有较强的裂解活性,当p H值超过9后活性开始降低;其对紫外线有一定的耐受能力,经紫外线照射0—9 min后裂解活性依然较强,12 min后活性开始下降,21 min后活性基本丧失;其对氯仿不敏感,5%浓度的氯仿对其活性基本没有影响。【结论】分离到了裂解性的青枯雷尔氏菌噬菌体,属于有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科,经过测定其各项生物学特性可知其潜伏期较短,裂解能力较强,具有很好的杀菌效果,且其裂解活性持续时间长,并能在不同温度、不同酸碱性的环境内有较强的适应能力,具有开发为抗青枯雷尔氏菌菌剂的潜力。

青枯雷尔氏菌脂肪酸型与致病性的关系

【目的】分析青枯雷尔氏菌脂肪酸种类变化与致病性指标-弱化指数和回接发病率的相互关系,提出青枯雷尔氏菌脂肪酸型种下分化的分类方法。【方法】青枯雷尔氏菌脂肪酸型分为:脂肪酸Ⅰ型,弱化指数>0.8,回接发病率0%,属无致病力型;脂肪酸Ⅱ型,弱化指数为0.6～0.8,回接发病率为6.7%～100%,属过渡型,脂肪酸Ⅲ型,弱化指数<0.6,回接发病率100%,属强致病力型。利用聚类分析、主成分分析、判别分析,分层筛选与脂肪酸型有关的脂肪酸种类.【结果】筛选出十四碳脂肪酸(X1)、十七碳脂肪酸(X9),十八碳脂肪酸(X13)为主要因子,组建数据矩阵,建立脂肪酸型判别模型:Y1=-16.3353+0.0012X1+0.0056X9-0.0016X13,Y2=-3.4928+0.0002X1+0.0003X9+0.0025X13,Y3=-9.1550-0.0003X1+0.0039X9+0.0042X13,对于一个未知脂肪酸型的青枯雷尔氏菌菌株,首先测定脂肪酸图谱,取出X1(十四碳脂肪酸)、X9(十七碳脂肪酸)、X13(十八碳脂肪酸),代入方程,计算Yi,当1≤Yi≤2时,归为脂肪酸型Ⅰ,当2≤Yi≤3时,归为脂肪酸型Ⅱ,当Yi>3时,归为脂肪酸型Ⅲ,模型的判别准确率达90.00%。【结论】青枯雷尔氏菌脂肪酸型的研究,为其种下分化建模的标准化和计算机自动分析方法的建立,提供可靠的基础。脂肪酸型的模型建立也为其他植物病原菌的致病性研究提供了思路和方法。

不同条件对烟草青枯雷尔氏菌生长的影响

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是烟草青枯病的病原菌.为有效防治青枯病,研究了不同培养条件对青枯雷尔氏菌生长的影响;并测定了在不同pH、温度以及在培养基中添加不同浓度的N、P、K、Zn2＋、Cu2＋、Ca2＋、Mg2＋、HCO3-、SO42-对青枯雷尔氏菌生长的影响.结果表明,青枯雷尔氏菌在偏酸和偏碱条件下生长较好,青枯雷尔氏菌最适生长温度为25～45 ℃;高浓度的Zn2＋和Cu2＋能够有效抑制青枯雷尔氏菌的生长,其他因素对青枯雷尔氏菌的生长无明显作用.

云南省烟草上青枯雷尔氏菌的致病力、生化型和致病型研究

为了解云南省烟草上青枯雷尔氏菌的多样性,对分离自云南省6个县烟草病株的菌株进行了致病力、生化型和致病型测定。烤烟品种K326的离体叶片致病力测定结果表明,165个青枯雷尔氏菌株可划分为强、中、弱3种致病力类群,分别占45.4%、46.7%和7.9%,强、中致病力菌株占优势。对其中具代表性的81个菌株的生化型测定结果表明,43个菌株分别属于生化型Ⅲ,占53.1%;32个菌株分别属于生化型Ⅲ-1,占39.5%;6个菌株分别属于生化型Ⅲ-2,占7.4%。对其中55个来自不同采集地点和不同致病力菌株的致病型测定结果表明,弱毒力(Ⅰ)型菌株的比例最高,占63.6%,中毒力(Ⅱ)型菌株的比例其次,占27.3%,强毒力(Ⅲ)型菌株的比例较少,占9.1%。菌株致病型的地理分布存在较大差异。