日本对虾(Penaeus japonicus)病原需钠弧菌(Vibrio natriegens)表型与分子特征及LAMP检测方法的建立

采用常规表观生物学特性及16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索与系统发育学分析等方法,对分离自江苏连云港某育苗场的大批死亡日本对虾蚤状幼体的优势生长菌进行了综合鉴定。结果表明,其形态和生理生化特征与弧菌属的需钠弧菌相近;16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索也均与需钠弧菌相似性最高,分别为98%、89%和95%,且三种基因的NJ系统发育树也均与需钠弧菌聚为一个分支;分离菌的致病性试验表明其半数致死量LD50为1.8×106CFU/ml。综合分离菌的致病性、形态与生理生化特征及基因同源性与系统发育分析结果,认为引起日本对虾蚤状幼体大批死亡的病原为需钠弧菌。基于gyrB基因序列设计1套LAMP特异性引物,建立了需钠弧菌的快速特异性检测方法,可用于由需钠弧菌引起的水产动物疾病的诊断及分子流行病学的调查研究。

需钠弧菌(Vibrio natriegens)合成聚羟基丁酸的研究

研究结果表明 ,V .natriegens可以利用葡萄糖、果糖、以及糖蜜为碳源合成聚羟基丁酸 [Poly(3HB) ];当以糖蜜为碳源时 ,积累的Poly(3HB)达到细胞干重的 2 8.4%。实验结果还表明 ,Poly(3HB)的积累滞后于细胞生长 ,在培养前加入过量的碳源 ,不仅没有Poly(3HB)积累 ,还抑制细胞的生长。测定了与Poly(3HB)合成相关的PHA聚合酶、β 酮硫解酶和乙酰乙酰CoA还原酶的活性。结果表明 ,伴随Poly(3HB)合成 ,PHA聚合酶活性从无到有 ,β 酮硫解酶活性提高了 10倍以上。进一步通过利用脂肪酸合成代谢抑制物———浅蓝菌素 (cerulenin) ,研究了脂肪酸从头合成途径与Poly(3HB)合成途径的关系 ,发现浅蓝菌素能够明显降低细胞Poly(3HB)的累积。根据以上结果 ,推测在V .natriegens中可能存在有两条代谢途径参与Poly(3HB)

文蛤病原菌——需钠弧菌的鉴定和生物学特性分析

从患病文蛤Meretrix meretrix体内分离出一优势菌株WT01,回归感染试验证明是文蛤的致病菌。对该菌形态、生理生化特征、盐度、温度和pH值生长条件以及16S rRNA基因序列进行了研究。结果表明,该菌为革兰氏阴性菌,发酵葡萄糖产酸不产气,氧化酶阳性,生长需NaCl,无色素,不发光,在TCBS平板上形成圆形黄色菌落,对弧菌抑制剂O/129敏感,具有弧菌属的典型特征。16SrRNA基因序列分析表明,该菌与需钠弧菌Vibrio natriegen的亲缘关系最为接近,其同源性达99%以上。因此,将该菌鉴定为需钠弧菌。实验显示其半数致死量为5.5×106CFU/g。19种抗菌药物药敏试验结果表明,该菌对氟哌酸、复方新诺明、菌必治、先锋必、链霉素、氯霉素和庆大霉素等抗生素较为敏感。并对其胞外产物的生物学特性进行了分析。

船用钢需钠弧菌附着腐蚀电化学噪声特征分析

选取船用钢板DH34为研究对象,将试验钢板浸泡于需钠弧菌培养液中和无菌培养液中进行腐蚀试验,对比分析了该材料在需钠弧菌培养液中的腐蚀特征。采用扫描电镜观察腐蚀形貌,结果表明在需钠弧菌培养液中试样发生局部点蚀,而在无菌培养液中则为全面腐蚀。对腐蚀过程进行了噪声电压和噪声电流的采集,时域和频域分析表明:在有需钠弧菌的培养液中,电压噪声功率谱的高频斜率高于-20dB/dec,截止频率大于0.2 Hz,起始两天噪声的点蚀指数接近于1;而在无菌的培养液中,电压噪声功率谱的高频斜率小于-20dB/dec,截止频率低于0.2Hz。需钠弧菌的培养液中噪声电阻值高于无菌培养液中噪声电阻值。点蚀指数、噪声功率谱密度的高频斜率和截止频率可用于判断需钠弧菌附着时船用钢板DH34的腐蚀行为。

DH36钢在需钠弧菌、芽孢杆菌以及混菌腐蚀体系中的腐蚀行为

目的研究需钠弧菌与芽孢杆菌分别单独培养以及混合培养时对海洋工程钢DH36腐蚀行为的影响,为海洋环境下材料的腐蚀发生规律探讨以及微生物腐蚀防治提供依据。方法通过扫描电子电镜、能谱仪、电化学设备等仪器,分析DH36钢在不同腐蚀体系中的腐蚀形貌信息以及电化学特征。结果SEM图显示,芽孢杆菌在DH36钢表面上的贴附量较大,需钠弧菌与混菌腐蚀体系中,生物膜、锈层构成的混合层存在很多的裂纹、缝隙,致密性较差。电化学结果显示,试样表面均出现两个时间常数,在低频处出现感抗特征。芽孢杆菌腐蚀体系中的腐蚀速率先增大后减小,浸泡3 d后需钠弧菌腐蚀体系中的腐蚀速率介于芽孢杆菌与混菌腐蚀体系之间。与单菌种腐蚀体系相比,混菌腐蚀体系中的开路电位最低,且浸泡7 d后的腐蚀速率最大,达到13.53μA/cm^2。结论在浸泡后期芽孢杆菌显示出腐蚀抑制效果,在需钠弧菌与混菌腐蚀体系中,由于细菌代谢产生了腐蚀性产物以及形成了致密性较差的混合层,试样腐蚀速率不断加快,但混菌的促进作用更显著。

贝叶斯优化方法在需钠弧菌生产1,3-丙二醇中的应用

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,生物法发酵制备1,3-丙二醇具有操作简便、反应条件温和、副产物少等优点,使用需钠弧菌作为新的工业底盘细胞生产1,3-丙二醇有很好的应用前景。高产菌株的构建过程中优化基因强度组合时,具有单次实验周期长、成本高且体系复杂、非线性强的特点。为了实现对1,3-丙二醇合成途径关键基因强度组合的快速优化,使用了一种以高斯过程回归算法为代理模型,以增益期望为采集函数的贝叶斯优化方法。在每轮迭代中,高斯过程回归算法用于拟合当前数据并预测未知点的概率分布,增益期望函数将概率分布映射到解空间中,选择解空间中最大值对应的点作为下一轮的实验点,实验后进入下一轮迭代。构建高产1,3-丙二醇的需钠弧菌过程中使用贝叶斯优化方法优化关键基因强度组合,在三轮迭代后搜索到了最优的基因强度组合,1,3-丙二醇的产量达到(13.01±0.63)g/L,较第一组实验点中最高值提高了8.32%。

弧菌拮抗菌的筛选及其对凡纳滨对虾的抑菌防病作用

从海洋沉积物中分离到2株弧菌拮抗菌(H2和H4),经生理生化特性、16S rRNA基因序列分析分别鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus H2)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis H4).H2和H4菌株均对需钠弧菌的生长有显著的抑制作用;但只有H2菌株在模拟养殖动物小肠环境中生长良好.选择H2进行模拟试验(20尾凡纳滨对虾虾苗为1组).结果表明,对照组(不接种)虾苗存活32h,接种弧菌的试验组虾苗仅存活16h,同时接种H2菌株和弧菌的试验组虾苗存活48h,而仅接种H2菌株的试验组虾苗存活了72h,说明菌株H2可显著提高凡纳滨对虾的存活时间.现场试验中,100L养殖池中(50尾虾/池),分别接种0(对照),103,104CFU/mL的H2菌株并养殖14d,再用104CFU/mL需钠弧菌处理14d.接种104CFU/mL H2菌株的试验组,虾的死亡率仅为12.5%,显著低于对照组的30.8%(P<0.05).接种104CFU/mL菌株H2的试验组,虾的体长、体重都略高于对照组,但各试验组之间差异不显著(P>0.05)。

海湾扇贝幼体期流行性弧菌病的研究

从辽宁兴城育苗场和辽宁省海洋水产研究所育苗室患面盘解体的海湾扇贝ArgopectenirradiansLamarck幼体中分离出6株菌,经感染试验表明,其中3株菌B01、Y01和Y02为病原菌。根据菌体形态及生理、生化测试,B01鉴定为需钠弧菌Vibrionatriegen,Y01和Y02具有相同的形态、生理、生化特征,鉴定为弧菌属Vibrio。需钠弧菌对庆大霉素、痢特灵、菌必治、诺氟沙星、氯霉素、环丙沙星、多粘菌素B敏感;Y01和Y02菌对诺氟沙星、菌必治、氯霉素、复方新诺明、环丙沙星、磺胺异唑敏感。对海湾扇贝育苗水体中细菌总数和弧菌数量的监测结果表明,幼体发生病变之前的水体中,细菌和弧菌的密度高于正常育苗水体的。文中还对病原菌的传播途径等问题进行了讨论。

普鲁兰酶在需钠弧菌中的分泌表达与发酵优化

普鲁兰酶是一种淀粉脱支酶,因其分子量较大,胞外分泌表达难度较高。需钠弧菌(Vibrionatriegens)是一种新型的蛋白表达宿主,拥有高效的蛋白合成效率。本研究使用基因组整合T7 RNA聚合酶表达框的V.natriegens VnDX为宿主,构建了产全长普鲁兰酶PulA及其截短突变体PulN2的重组需钠弧菌,分析了信号肽、发酵温度、诱导剂浓度、甘氨酸浓度及发酵时间等条件对产酶的影响,并且对比了2种普鲁兰酶在V.natriegens VnDX与大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中的胞外产酶能力。研究结果显示,普鲁兰酶PulA和PulN2在V.natriegens VnDX中的胞外酶活为61.6 U/mL和64.3 U/mL,分别为E.coli BL21(DE3)最大酶活力的110%和62%。上述结果表明V.natriegens VnDX可以分泌表达大分子量的全长普鲁兰酶PulA,本研究可为其他大分子量蛋白在V.natriegens VnDX中的分泌表达提供参考和借鉴。

一株产褐藻胶裂解酶的需钠弧菌筛选及酶解产物分析

[背景]褐藻胶裂解酶种类丰富、降解机制多样,是高效环保降解褐藻胶、制备褐藻寡糖的工具酶,成为褐藻植物高值化开发利用的研究热点。[目的]从海泥中筛选获得褐藻胶裂解酶高效产酶菌株,确定菌株发酵产酶最优条件,鉴定和分析酶降解产物,进而解析该酶的降解特性。[方法]以褐藻胶为唯一碳源,从海带养殖场附近海泥中筛选菌株,通过形态学观察、生理生化实验和16S rRNA基因序列比对进行菌种鉴定。优化发酵培养基并利用筛选菌株进行发酵产酶。利用红外和阴离子交换色谱分析不同程度酶解产物以确定该酶的降解偏好,利用薄层色谱和液相色谱-质谱鉴定酶降解的终产物。[结果]筛选鉴定得到一株产褐藻胶裂解酶的需钠弧菌(Vibrio natriegens)SK42.001,最优产酶培养基为海藻酸钠8.0 g/L、(NH_(4))2SO_(4)8.0 g/L、NaCl 30.0 g/L、MgSO_(4)·7H_(2)O 5.0 mmol/L和K_(2)HPO_(4)·2H_(2)O 10.0 mmol/L,发酵酶活为(5.20±0.14)U/mL。菌株所产酶偏好于降解褐藻胶中的古罗糖醛酸片段,并且终产物聚合度较为单一,主要为褐藻三糖。[结论]筛选到褐藻胶裂解酶高效产酶菌株Vibrio natriegens SK42.001,该菌株所产酶具有古罗糖醛酸降解偏好性且可特异性生产褐藻三糖,具有进一步开发用于大规模制备褐藻胶裂解酶或褐藻寡糖生物制品的潜力。

新型生长快速需钠弧菌基因组无痕编辑体系构建

需钠弧菌Vibrio natriegens作为近几年发展起来的一种新型生长快速底盘细胞,在合成生物学领域展现出良好的应用前景。基因组编辑是合成生物学研究中不可或缺的遗传操作手段。但是,开展需钠弧菌的合成生物学研究仍然有待进一步发展精准、高效的基因组编辑系统。针对这个问题,首先对6株需钠弧菌的生理表型进行检测,选取生长快速、表型稳定的CICC 10908菌株作为基因组编辑研究的宿主细胞。其次,建立并优化需钠弧菌自然转化系统。优化后的系统将筛选标记基因cat-sacB或KanR整合到需钠弧菌染色体上的同源重组效率分别达到4×10^–5和4×10^–4。再次,在优化的自然转化系统基础上,利用双向选择性筛选方法,建立了精准、高效的需钠弧菌基因组无痕编辑体系。通过测试,基因敲除、回补、插入和替换这4种不同类型基因编辑的阳性率分别为93.8%、100%、95.7%和100%。最后,需钠弧菌可以实现质粒的高效转化和消除。该工作为需钠弧菌合成生物学研究提供精准、高效的基因组无痕编辑手段。

需钠弧菌外膜囊泡的蛋白质组分析与异源蛋白的递送(英文)

【背景】需钠弧菌(Vibrio natriegens)是一种快速生长的革兰氏阴性菌,作为一种新兴工具在生物技术领域有重要的应用潜力。此前的研究主要集中在开发利用V.natriegens成为体内外重组蛋白生产的工具。然而,许多支持细菌进行快速生长和蛋白质生产的生理活动大部分仍未确定。外膜囊泡(Outer Membrane Vesicle,OMV)是由革兰氏阴性细菌普遍产生的一种球形小泡,其不仅具有重要的功能,而且还可以作为一种应用于疫苗治疗的高效运载工具。【目的】表征指数生长期OMV的蛋白质组并利用OMV进行异源蛋白的递送。【方法】使用透射电镜、动态光散射和质谱学的方法,观察OMV的形态及粒径分布并鉴定蛋白组成。以超折叠绿色荧光蛋白(Superfolded Green Fluorescent Protein,sfGFP)作为货物蛋白来确定OMV蛋白载体。【结果】从细菌培养的指数期中期和末期分别提取的OMV中鉴定到了288个和317个蛋白。这些蛋白分属不同的功能组,包括ABC转运蛋白、鞭毛、双组分系统。相比之下,同时鉴定了全细胞样品,其在指数期中期和末期分别含有1480个和1565个蛋白。我们筛选OMV的蛋白作为候选载体发现了一种属于OmpA家族的蛋白(命名为OmpA24),其能够将sfGFP以融合货物蛋白的形式运载到OMV中。【结论】首次证实V.natriegens能够在指数生长期产生OMV,并展示了第一个不同生长时期OMV和全细胞的蛋白质组鉴定结果。OmpA24是将外源融合货物蛋白呈递到OMV中的有前景的载体。本研究有助于促进V.natriegens在蛋白表达和OMV介导的分泌中的应用。

水体中添加两种菌剂对凡纳滨对虾存活、生长及消化酶活力的影响

向水体中添加不同浓度的短小芽孢杆菌CGMCC 1004(Bacillus pumilus)和胶红酵母菌CGMCC1013(Rhodotorula mucilaginosa)以研究凡纳滨对虾(Litoenaeus vannamei)体长、体质量、存活率、胃蛋白酶、肝胰腺淀粉酶和肝胰腺脂肪酶的影响,以及需钠弧菌(Vibrio natriegens)的感染效果。结果表明:向水体中添加104CFU/mL短小芽孢杆菌能提高对虾体长、存活率,但结果不显著,但对体质量增长率具有显著提高作用;水体中添加104CFU/mL短小芽孢杆菌对提高需钠弧菌感染后对虾成活率有一定的提高作用;水体中添加104CFU/mL短小芽孢杆菌能显著提高胃蛋白酶活性,但是对肝胰腺淀粉酶活性有一定抑制作用;添加复合菌剂比添加单一菌种的作用要好;亦证明了向水体中添加细菌的方式对凡纳滨对虾的体长、体质量、存活率以及水质指标影响比较小,但是对消化酶具有一定的提高作用。

304不锈钢在混合菌种共同作用下的腐蚀行为

利用间歇式方法培养海水中硫酸盐还原菌和需钠弧菌,采用自腐蚀电位、极化曲线、冷场扫描电镜观察等方法,研究了304不锈钢在硫酸盐还原菌和需钠弧菌共同作用下的腐蚀电化学行为,分析了东海中的微生物腐蚀特征和机理.结果表明:硫酸盐还原菌和需钠弧菌在混合培养过程中相互促进生长,在混合微生物介质中的腐蚀速率大于在单一微生物中的腐蚀速率;混合微生物的共同作用使微生物膜加大加厚以及产生更多的腐蚀产物和代谢物,加速了不锈钢钝化膜的溶解,进而加速了304不锈钢表面的点蚀.

白铜在两种海洋优势菌种环境中的腐蚀行为研究

利用间歇式方法培养硫酸盐还原菌和需钠弧菌,并采用自腐蚀电位、极化曲线、冷场扫描电镜观察等方法,研究了白铜在海洋优势菌种硫酸盐还原菌和需钠弧菌共同作用下的腐蚀电化学行为。结果表明:海洋微生物的存在加速了白铜的腐蚀进程;硫酸盐还原菌在混合菌种培养基中对白铜的腐蚀起主导作用;硫酸盐还原菌和需钠弧菌共同作用下基体表面团聚现象严重,倾向于发生点蚀;微生物对基体腐蚀影响严重程度依次为:硫酸盐还原菌、混合菌、需钠弧菌、无菌。

三疣梭子蟹病原菌检测与分析

分离患病三疣梭子蟹样本中的病原菌,对分离菌株进行形态特征、理化特性和分子生物学鉴定。采用普通营养琼脂及zobell2216E海水营养琼脂分离患病样本中的病原菌。采用细菌常规生化鉴定方法,了解细菌的形态和生理生化特性。采用16SrRNA和gyrB基因序列同源性比对,进一步明确该病原菌的分类学地位。采用人工感染实验的方法,证明分离菌株是三疣梭子蟹致病病原菌。该菌革兰氏阴性,氧化酶阳性,葡萄糖发酵型,在低于10 g/L的NaCl胨水中不生长。16SrRNA和gyrB基因与需钠弧菌(Vibrio natriegen)同源序列具有99%的相似性。分离菌株对三疣梭子蟹有明显的致病性。需钠弧菌是引起江苏省连云港市赣榆县石桥镇九里村三疣梭子蟹严重死亡的病原菌。

Q235钢焊接熔合区在混合菌共同作用下的腐蚀行为

通过观察腐蚀形貌,测量极化曲线和阻抗谱,研究了Q235钢熔合区在SRB和V.natriegens共同作用下的腐蚀行为。研究表明,熔合区的腐蚀程度,单一菌溶液中,SRB大于V.natriegens,混合菌溶液大于单一菌;混合菌溶液中SRB和V.natriegens表现出协同作用,加速试样的腐蚀;试样的耐腐蚀性能,熔合区小于焊缝区小于母材区。

Q235钢正火区微生物腐蚀电化学行为研究

通过测量极化曲线和阻抗谱,研究了Q235钢正火区在SRB和V.natriegens共同作用下的腐蚀行为。研究表明,正火区的腐蚀程度,单一菌溶液中,SRB大于V.natriegens,混合菌溶液大于单一菌;混合菌溶液中SRB和V.natriegens表现出协同作用,加速试样的腐蚀。

引起中国对虾红腿病的两种新病原菌的研究

文内报导了引起中国对虾“红腿病”的两种新病原菌,这两种菌均从患“红腿病”病虾的心脏、血淋巴液或肝脏中分离获得,经系统分类法及DNA分子中(G+C)mol％测定分别隶属于哈氏弧菌和需钠弧菌。感染试验证实这两种菌均能侵入虾体引起红腿病并导致死亡,死亡率达90％以上。在感染死亡虾体内可再次分离到与感染用菌形态相同的菌体。

一株转化琼胶为新琼寡糖菌株的筛选及鉴定

【目的】筛选一株可以将琼胶转化为新琼寡糖的菌株,并对该菌株进行鉴定。【方法】从紫菜生长区域采集紫菜和该区域海水,用含1‰琼胶的培养基富集培养,逐级稀释涂布、平板划线进行初筛,液体培养进行复筛,DNS法测定琼胶降解产物中还原糖的含量。通过16S r DNA序列分析,结合菌体形态、菌落特征及生理生化特性,确立该菌的系统发育学地位。【结果】从紫菜振荡液中筛选出一株可以产琼胶酶的菌株HJPHYXJ-1,该菌属于革兰氏阴性菌,16S r DNA序列同源性与需钠弧菌(Vibrio natriegens)的达到了99%,结合形态特征和生理生化实验结果鉴定该菌为需钠弧菌。HPLC法测定酶解产物为新琼寡糖。【结论】HJPHYXJ-1被筛选用于转化琼胶,酶解产物的聚合度在2-12之间,是以二糖为单位的新琼寡糖,该菌产生的酶为β-琼胶酶。