霍乱弧菌毒素协同调节菌毛基因tcpA的克隆及序列分析

目的 以新疆分离 0 13 9霍乱弧菌XJ93 0 0 6株的DNA为模板 ,自行设计引物克隆毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因 (包括侧序列 )并构建重组载体。方法 以 0 13 9霍乱弧菌新疆分离株XJ93 0 0 6基因组DNA作为模板 ;根据O1群E1Tor型霍乱弧菌N16961全基因组序列设计tcpAPCR引物 ,高保真酶扩增tcpA片段 :限制性内切酶切PCR产物和pNEB193空质粒 ,T4DNA连接酶连接酶切产物 ,重组质粒转化大肠杆菌TB1工程菌 ,蓝白斑菌落试验筛选阳性克隆 ;提取质粒经酶切鉴定后测序并利用生物信息数据库对该序列进行序列分析 ,比较。结果 DNA限制性内切酶可从重组质粒pNEB193_tcpA的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间切出一个10 3 7bp的DNA片段 ,测序结果与O1群E1Tor型霍乱弧菌N16961、O13 9霍乱弧菌标准株M0 45的tcpA同源性均达到 99 9%以上。结论 成功构建O13 9霍乱弧菌新疆分离株XJ93 0 0 6毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因的重组质粒pNEB193_tcpA ;序列分析表明霍乱弧菌毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因在O1群EITor型霍乱弧菌和O13 9霍乱弧菌中是一类高度保守的原核基因 ,可作为霍乱弧菌疫苗的候选基因。另外为研究O13

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。

霍乱弧菌内毒素诱导大鼠葡萄膜炎的组织切片研究

目的 本研究用霍乱弧菌内毒素诱导大鼠葡萄膜炎 ,建立全葡萄膜炎的动物模型 ,以期研究该病的发病机制和有效的治疗方案。方法 应用纯化后霍乱弧菌内毒素注射于 Wistar大鼠 ,分别于注射后 4、8、12、16、2 4 h裂隙灯显微镜观察双眼前节变化 ,及病理组织学观察。结果 注射内毒素后 4 h出现炎症 ,12 h反应达到最重 ,表现为瞳孔缩小、虹膜水肿、血管充血扩张、严重者前房渗出、积血。组织学观察可见前房睫状体、虹膜水肿血管扩张充血 ,脉络膜水肿加剧 ,血细胞弥漫性渗出 ,视网膜有脱离。节细胞数量 ,视网膜厚度 ,节细胞大小 ,节细胞层血管数量及大小 ,内核外网层血管数量及大小都有明显的变化。结论认为该方法用于诱导葡萄膜炎动物模型是成功的。同时还比较了内毒素和

霍乱弧菌蛋白酶PrtV对霍乱弧菌溶细胞毒素引起人肠上皮细胞炎性反应的修饰

目的研究霍乱弧菌分泌的蛋白酶PrtV(Vibrio cholerae protease,PrtV)对霍乱弧菌溶细胞毒素(Vibrio cholera cytolysin,VCC)引起人肠上皮细胞炎性反应的修饰作用。方法用VCC或PrtV处理后的VCC刺激人单层肠上皮T84细胞体外模型上层腔面,分析细胞受刺激后通透性和细胞活性改变以及细胞因子白细胞介素-8(interlukine-8,IL-8)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因表达。结果VCC可引起极性的肠道T84细胞的炎性反应,表现为通透性增加和IL-8以及TNF-α基因表达增加。纯VCC蛋白在浓度为160ng/ml时引起肠上皮细胞炎性反应,而高浓度的VCC则导致肠上皮细胞损伤。VCC经PrtV处理后对肠上皮细胞炎性作用明显消失。结论结果表明VCC在低浓度时引起肠道上皮的局部免疫防御反应,而高浓度的VCC则直接导致肠道上皮细胞损伤。此外,PrtV可以介导由VCC引起的肠上皮细胞炎性反应的修饰作用。

O139霍乱弧菌肠毒素核苷酸序列分析

目的 探讨O139霍乱弧菌肠毒素 (CTX)核苷酸与O1群霍乱CTX毒素核苷酸序列异同。方法 用聚合酶链反应、DNA序列分析测定 2株O139群、2株O1群古典型、2株O1群ElTor型霍乱弧菌CTXA2 B亚单位核苷酸。结果 2株O139群霍乱弧菌均含有CTXA2 B亚单位基因 ,O139群与O1群CTXA2 B核苷酸同源性为 97.1%～ 98.9%。结论 O139群与O1群霍乱弧菌CTXA2 B核苷酸基本同源。进一步证实两者CTX核苷酸序列一致。

2005年-2010年武汉市霍乱弧菌监测分析

目的:对2005年-2010年霍乱弧菌监测中分离的25株疑似菌株进行系统鉴定。方法:分离培养、血清学试验、系统生化鉴定(VITEK32)、PCR检测其分型及毒素基因、药敏试验。结果:25株菌鉴定为霍乱弧菌的有21株,与霍乱弧菌发生交叉凝集4株;病例监测主要为O139霍乱弧菌、外环境监测主要为O1群霍乱弧菌;病例监测菌株携带霍乱弧菌毒素基因(ctxAB)、其他菌株均不携带霍乱弧菌毒素基因(ctxAB)。药敏实验结果对诺氟沙星和环丙沙星敏感,对其他抗生素有不同程度的耐药。结论:武汉市霍乱弧菌在病例监测中主要为O139群霍乱弧菌产毒株、外环境监测中主要为O1群霍乱弧菌非产毒株,不同型别菌株存在不同程度耐药性。

基因重组幽门螺杆菌HspA—Zot融合蛋白质口服疫苗的研制

目的制备幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(HspA)和霍乱弧菌封闭小带毒素(Zot)的重组融合蛋白质HspA—Zot(HZ)；观察融合蛋白HZ经口服免疫后在小鼠小肠内的吸收情况；观察HZ经口服免疫后诱发小鼠产生的特异性免疫应答反应。方法①用PCR方法扩增HspA和Zot两个目的基因片段，将它们分别克隆至pSK(+)质粒上，然后插入含T7启动子pET一28a(+)的表达载体中，构建含双基因的表达质粒pET—hz，转化E，coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达高效的融合蛋白HZ；②融合蛋白经镍离子柱纯化、复性后，与HspA重组蛋白质共同标记同位素^125I，经小鼠灌胃实验观察其在小鼠小肠内的吸收情况。结果①经测序，hspA-zot(hz)融合基因片段由1 575bp组成，为编码515个氨基酸残基的多肽。经SDS—PAGE检测发现，融合基因表达的蛋白质相对分子质量(M)r约为65×10^3。②标记同位素^125I的HZ和HspA，经小鼠灌胃实验观察不同时间段的吸收，情况，结果发现在5～10min时间段，HZ组出现吸收峰值，约为对照组的8．65倍(P<0．001)，且吸收峰值时问明显提前。结论融合蛋白质HZ经口服后可以在小鼠小肠内迅速被大量吸收，经口服免疫后可以刺激机体产生较高滴度特异性抗体。HZ可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的候选口服疫苗株。

活髓切断术盖髓剂研究进展

活髓切断的理念最先由Witzel等于1872年最先提出,他使用砷使冠髓失活,然后使用暂封剂暂封[1-3].Lepkowski于1897年使用经甲醛处理的霍乱弧菌肠毒素盖髓,活髓保存成功率达99%[4]. 随后Buckley提出可以使用甲醛甲酚合剂处理冠髓[5]. 直到20世纪20年代早期Davis首次提出手术切除冠髓组织,保留正常根髓,活髓切断术操作指南逐步成熟[6]. 1968年Redig提出了我们现在临床上常用的一次性活髓切断术[7,8].盖髓剂在活髓切断术的发展过程中不断创新和改进,理想的盖髓剂应当具有抗炎、抗菌、诱导软硬组织修复等作用,盖髓剂的应用对活髓保存起着重要作用.

滕州市185株弧菌及肠毒素检测分析

目的探讨滕州市弧菌种类、分布、构成特征和毒力因子。方法对就诊的急性腹泻病人采集腹泻便，按《卫生防疫细菌检验》提供的方法进行弧菌分离鉴定及肠毒素检测。结果1992～201i年共检测急性腹泻病人粪便4847份，检出各类弧菌185株，检出率为3．82％。其中以非O1群霍乱弧菌为主126株占68．i1％，其次是河弧菌16株占8．65％、梅契尼柯夫弧菌和弗尼斯弧菌各12株各占6．49％、溶藻弧菌9株占4．86％、副溶血弧菌8株占4．32％、霍乱弧菌2株占1．08％。结论在检出的弧菌中，以非O。群霍乱弧菌为主要菌群，另外还有霍乱弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、溶藻弧菌、梅契尼柯夫弧菌和副溶血弧菌。非0。群霍乱弧菌能产生CT，与其致病性密切相关；NAG-ST是非0。群霍乱弧菌一种主要毒力因子。