用PCR体外定点突变技术诱导霍乱毒素A亚基突变体的构建

目的： 有效去除霍乱毒素Ａ 亚基（ ＣＴＡ） 的毒性作用而保存其佐剂性能。方法： 采用ＰＣＲ 体外定点突变技术（ＰＣＲＳＤＭ） ，设计两对引物，引入一个突变位点，通过重叠延伸法两次ＰＣＲ 扩增，使ＣＴＡ 编码基因第６３ 位密码子由ＣＴＣ 突变为ＴＴＴ，亦将扩增片断克隆入ＰＵＣ１９ 载体。结果： ＤＮＡ 测序结果表明在预期位点已发生突变，用ＰＣＲ 诱导成功ＣＴＡ 突变体。结论： ＰＣＲ 诱导突变准确、简便，为深入研究ＣＴ

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因(ctxA)的融合表达载体,并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基(CTA)免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板,PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-CTA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET-ctxA,经SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。