烟草生产霍乱毒素B亚单位疫苗的免疫分析

用纯化的CTB后腿肌肉注射免疫小鼠 ,每次 12 .5 μg ,每隔 14天加强一次 ,共注射三次 ,末次免疫后两周收集血清 ,免疫小鼠诱导产生了特异性抗CTB抗体。在CHO细胞中 ,免疫小鼠血清能够中和CT的细胞病变效应 ;小鼠肠结扎实验表明 ,抗CTB血清能够抑制CT结合细胞表面受体GM1神经节苷脂。

霍乱毒素B亚单位嵌合体防龋疫苗研究进展

霍乱毒素B亚单位嵌合体防龋疫苗能诱导机体产生显著的免疫抗龋反应,尤其是唾液腺的IgA抗体反应,能有效地阻止致龋菌在牙面的聚集和龋坏的发生,可望成为一种安全、高效的防龋疫苗。

霍乱毒素B亚单位在疫苗研究中的应用

CTB不同于CT,没有毒性,在体内和体外CTB具有强的免疫调节活性。越来越多的证据表明CTB在疫苗研究中发挥重要作用。深入理解CTB的免疫调节机制及其在疫苗研究中的应用,有助于设计新疫苗和改良疫苗。因此,将对CTB在疫苗研究中的应用进展进行综述。

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄果实中特异性表达及其免疫原性的研究

利用番茄果实特异性启动子-E8启动子,将霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)用根癌农杆菌浸润法转入番茄植株,并使其在果实中特异表达,然后对试验小鼠进行口服免疫,研究转基因番茄果实的免疫原性。结果表明,ctb基因在14株番茄植物基因组中被证实有整合,并在其中2株的番茄果实中有特异性表达,最高表达量分别为455和385 ng·g-1FW,口服免疫后的小鼠血液和肠道粘膜中均检测到抗CTB抗体。表明获得了在番茄果实中特异、高效表达霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)的植物口服疫苗候选植株。

霍乱毒素B亚单位的研究进展

目的 介绍霍乱毒素B亚单位最新研究进展。方法 从霍乱毒素B亚单位的基因表达、作为载体蛋白与免疫佐剂的应用、与免疫原的不同使用方法和不同的免疫途径对其免疫佐剂作用的影响等方面进行介绍。结果 霍乱毒素B亚单位是有较好应用前景的载体蛋白 ,具有较强的佐剂活性 ,可以增强细菌、病毒以及其他抗原的免疫原性。

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄中表达的研究

将霍乱肠毒素 B亚单位 (CT-B)基因及内质网引导序列 (SEKDEL)克隆到质粒 p RTL2和 p BI1 2 1中 ,分别构建植物双元表达载体 p BI-CTB和 p BI-CTBK,CT-B基因由 Ca3 5 S启动子控制表达 .采用叶盘法经根癌农杆菌介导转化番茄 (金丰 1号 ,Jinfeng1 ) ,各表达载体得到一批转基因植株 .经 PCR和 Southern blot分析表明 CT-B基因整合到了番茄基因组中 ;ELISA和 Western blot分析表明 p BI-CTB和 p BI-CTBK的转基因植株能够有效表达 CT-B多肽 ,分别占番茄叶片可溶性蛋白的 0 .0 5 5 %和 0 .0 84% .

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。

变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因转基因黄瓜植株的获得及鉴定

目的:经农杆菌介导将变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因导入黄瓜,获得转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的研究提供实验基础。方法:利用双元载体pCAMBIA2301构建变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合质粒(PAcA-ctxB)的植物表达载体p2355-PAcA-CTB;电转化法导入农杆菌EHA105;采用叶盘转化法转化黄瓜,转基因植物经过卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测目的基因鉴定。结果:成功得到转基因黄瓜植株,卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测证实目的基因PAcA-ctxB已整合至黄瓜基因组中。结论:获得了含有变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因的转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的进一步研究提供了实验基础。

预防O139霍乱B亚单位/全菌体口服疫苗的研究

目的 研制预防O139霍乱的B亚单位／全菌体口服疫苗。方法 应用重组霍乱毒素B亚单位及福尔马林灭活的O139霍乱弧菌全菌体，构建成B亚单位／全菌体疫苗，并进行安全性及免疫原性检测。结果 经连续3天大剂量灌喂小鼠后，未见体重下降、发病或死亡现象。全部小鼠均健康活存。以腹腔或口服免疫小鼠后，均能产生外周血或肠道局部高滴度的特异抗体。免疫小鼠对O139活菌攻击有良好的保护作用。结论B亚单位／全菌体口服疫苗在小鼠试验中安全性及免疫原性良好。

霍乱毒素B亚单位工程菌MM2的表达与lac启动子的关系

研究了不同碳源(葡萄糖、乳酸和乙酸)以及IPTG诱导对工程菌MM2表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的影响,ctb基因位于lac启动子的下游。在YC培养基中分别加入0.048mol/L的葡萄糖、0.102mol/L的乳酸和0.167mol/L的乙酸,它们在完全氧化后可产生相同的能量。结果表明,加入葡萄糖会大幅度降低ctb基因的表达水平,其原因和培养过程中pH值下降有关;加入乳酸可提高ctb基因表达水平1.15倍,且不抑制菌体生长;加入乙酸可提高ctb基因的表达水平0.9倍,但对菌体生长有抑制作用。不同时间及不同浓度的IPTG诱导未能提高ctb基因的表达水平,说明lac启动子对ctb基因的表达没有影响或影响很小。

霍乱毒素B亚单位基因的克隆及其核苷酸序列分析

利用 PCR技术从含有霍乱毒素 B亚单位 ( CTB)基因的质粒 p UCT1中扩增出不包括信号肽的 3 0 9bp的 CTB全基因 ,并通过点突变技术消除了 CTB阅读框内的终止密码子 ( TAA→GAA) ,以便于在 CTB基因的下游融合其他的外源基因。用限制性内切酶 Bam H 和 Eco R 对 PCR产物进行双酶切 ,以 T4DNA连接酶将其定向连接于经同样酶切处理的质粒 p ET-2 8b( +)的多克隆位点上 ,构建成重组质粒 p ECTB,转化至BL2 1 ( DE3 )中。经 Bam H 和 Eco R 双酶切分析和 PCR扩增检测 ,证明重组质粒 p ECTB中含有 CTB基因。核苷酸序列分析表明 ,克隆的

纯化重组霍乱毒素B亚单位与天然霍乱毒素B亚单位性质的对比研究

霍乱毒素Ｂ亚单位（ＢＳ）已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体，但成本高，来源困难．用重组霍乱毒素Ｂ亚单位（ｒＢＳ）代替ＢＳ可克服上述缺点．ｒＢＳ用于上述目的前必须证实其在物理、化学及免疫学性质方面与天然同类产品的一致性．用亲和层析法从各批次大罐发酵所获工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２（ｐＭＭ－ＣＴＢ）培养物上清中制备得到了小批量ｒＢＳ纯品，在同等条件下与ＢＳ（Ｓｉｇ－ｍａ公司产品）进行理化、免疫学性质的对比研究，证实二者在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中电泳带位置一致、分子量相同，纯度达９９％；在反相ＨＰＬＣ中出峰行为一致，纯度达１００％；在半干式聚焦电泳分析中电泳带分布相同，等电点为７．９１．ｒＢＳＮ端起的２０个氨基酸序列为ＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＨＴＬ，与克隆基因来源株的毒素Ｂ亚单位同一段序列完全一致．氨基酸组成分析证实ｒＢＳ与ＢＳ相近．在免疫学性质分析中，ｒＢＳ与ＢＳ在免疫双扩散试验中与抗ＣＴ均出一条沉淀线且相互吻合；在免疫电泳试验中二者与抗ＣＴ在相应位置上产生一条沉淀弧；二者均能与神经节苷脂ＧＭ１结合且这种结合均可通过二者与抗ＣＴ的预保温处理而被阻断．对比研究结果揭示ｒＢＳ与ＢＳ性质完全一致，可代替ＢＳ用于?

变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因在转基因番茄中的表达

目的:在获得含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄原代种子的基础上,应用分子生物学技术检测外源基因在转基因植株中的表达,测定目的蛋白的含量。方法:PCR筛选含编码变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄植株;提取番茄果实总蛋白,用BCA试剂盒测定番茄果实总蛋白含量;通过Western印迹检测外源蛋白的表达情况,并用ELISA法对外源目的蛋白含量进行测定。结果:PCR扩增分析可见1.6 kb特异性扩增条带,出现特异性条带的植株占总检测植株的55.6%;转基因番茄总蛋白含量为3.93 mg/mL,Western印迹结果显示,在PVDF膜上,约60 kD处出现特异性条带;ELISA测得表达的目的蛋白占番茄可溶性总蛋白的0.18%。结论:含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白。

不同直径胶体金结合霍乱毒素B亚单位的逆行轴浆转运及其应用

不同直径胶体金结合霍乱毒素Ｂ亚单位复合物（ＣＢ－Ａｕ）注射于大鼠不同部位，观察对神经元的标记效果。实验结果：（１）ＣＢ－Ａｕ较ＣＢ－ＨＲＰ注射靶区扩散范围小，经银加强后ＣＢ－Ａｕ呈黑色致密的圆颗粒。（２）肌肉注射以５ｎｍ和１０ｎｍＣＢ－Ａｕ对神经元的标记效果较好，１７ｎｍＣＢ－Ａｕ几乎难以标记神经元。在中枢神经系统，此三种直径ＣＢ－Ａｕ标记效果相似。（３）银加强标认神经元后可复合免疫细胞化学（ＩＣＣ）方法，双标记神经元的银颗粒与ＩＣＣ反应产物极易分辨；由此发现大鼠ｃａｌ－ｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８Ｋ阴性和阳性的红核脊髓投射神经元。（４）ＣＢ－Ａｕ滞留神经元内至少３５ｄ，故可行慢性实验。因此在比目鱼肌注射ＣＢ－Ａｕ的第５天切除该肌，３０ｄ后经银加强复合用ＣＧＲＰＩＣＣ仍能清晰分辨标认的神经元。结果表明，ＣＢ－Ａｕ为一很好的轴浆转运示踪剂尤适合复合ＩＣＣ的双标研究。

变异链球菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合表达质粒的构建和表达

目的:构建含变异链球菌乳酸脱氢酶(LDH)和霍乱毒素B亚单位(CTB)嵌合原核表达质粒,并诱导表达融合蛋白。方法:应用PCR技术扩增LDH编码基因ldh和CT编码基因ctxB,定向克隆至原核表达质粒pET32a(+)上,通过限制性内酶切、PCR和序列测定分析鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达融合蛋白。结果:PCR扩增得到了ldh和ctxB;构建的质粒pET-LDH/CTB经KpnⅠ、XhoⅠ双酶切和目的基因PCR检测,均得到1.4 kb大小的片段,与预计目的基因片段大小相同;质粒pET-LDH/CTB中插入的ldh序列与GeneBank中ldh比较同源性为98%,ctxB的同源性达99%,插入的相位正确;经IPTG诱导表达了约70×103的蛋白。结论:成功构建了变异链球菌LDH和CTB嵌合表达质粒pET-LDH/CTB,并正确表达融合蛋白。

转基因烟草生产霍乱毒素B亚单位的纯化

提取转基因烟草叶片总蛋白 ,用经溴化氰活化的Sepharose 4B偶联有抗CTIgG色谱柱 ,得到了表达产物CTB蛋白质。经PAGE、Westernblot。

以霍乱毒素B亚基为佐剂的SARS病毒核酸疫苗的构建

由于冠状病毒主要通过粘膜系统侵人细胞,因此有效的粘膜免疫效应对于SARS的免疫预防具有重要作用。通过将SARS冠状病毒免疫保护相关的核衣壳蛋白和辐条蛋白与霍乱毒素B亚基基因融合,并克隆至真核基因表达载体,所构建的DNA候选疫苗在细胞内可表达霍乱毒素B亚基与SARS抗原的融合蛋白,从而可用于评价是否可有效产生粘膜免疫。

霍乱毒素B亚单位和旋毛虫幼虫抗原诱导黏膜免疫结果分析

目的探讨黏膜佐剂霍乱毒素B 亚单位（CT-B ）在激发旋毛虫感染的黏膜免疫中的作用。方法24只NI H 小鼠随机分为4 组，每组6 只。CT-B 免疫组：每只小鼠于0 、7 、14 d 用含幼虫抗原100 μg 、C T-B 10 μg 的免疫原200 μl 经口灌服；正常对照组；免疫后感染组：免疫方法同CT-B 免疫组，末次免疫后第7 天，每只小鼠用200 条旋毛虫进行感染；单纯感染组：不免疫，与免疫后感染组同时进行感染。CT 蛳B 免疫组与正常对照组在免疫后第7 天、免疫后感染组与单纯感染组在感染后第7 天分别取血检测Ig A 、Ig G 1 、Ig G 2 b ，刮取肠黏液检测sIgA ，检测肠道成虫数，并收集每鼠雌虫，在体外检查其生殖力。结果与单纯感染组相比，CT-B 免疫后感染组肠道成虫数明显减少，雌虫生殖力明显降低，成虫与新生幼虫减虫率分别为88.2%和72.4%。CT-B 免疫组小鼠肠黏液sIg A 、血清Ig A 较对照组小鼠明显提高(0 .2 9 ±0 .04 vs 0.09 ±0.02，0.21 ±0.06 vs 0.08 ±0.01，P <0.001)；而两组Ig G 1 和Ig G 2 b 水平无显著性差异(P>0.05)。CT-B 免疫后感染组小鼠肠黏液sIg A 、血清Ig A 较单纯感染组小鼠相比有显著性差异(0 .5 5 ±0 .28 vs0.08 ±0.15，0.33 ±0.06 vs 0.10 ±0.10，P <0.001)。