青杄转录共激活因子PwMBF1c的功能研究与验证

克隆通过青杄干旱转录组筛选到的差异候选基因PwMBF1c,对其生物学功能进行分析和验证,以期能够解析青杄的耐旱机理,并为培育优良抗逆林木品种提供基因资源。利用RT-qPCR技术分析PwMBF1c对干旱、高温、低温及激素处理的响应。瞬时转化烟草叶片和洋葱表皮细胞检测PwMBF1c的亚细胞定位。利用酵母单杂验证PwMBF1c的转录活性。在拟南芥和马铃薯体系中验证了PwMBF1c抗旱应答的功能。PwMBF1c主要在成熟叶中表达,其转录水平受干旱、高温、水杨酸(SA)诱导上调;PwMBF1c的C端具有转录激活活性,而N端和全长不具有转录活性;PwMBF1c定位于细胞膜、细胞质和细胞核;过表达PwMBF1c显著提高了拟南芥和马铃薯的耐旱性。干旱胁迫下,与对照组Col-0和VC相比,过表达拟南芥株系PwMBF1c-L1和PwMBF1c-L2存活率更高,叶绿素含量较高,MDA含量较低;在PEG处理后,与野生型马铃薯Y5相比,过表达PwMBF1c显著提高了苗高。PwMBF1c的表达水平受干旱等多种逆境和激素的诱导,PwMBF1c主要定位于细胞膜、细胞质和细胞核,且该蛋白的C端具有转录激活活性。PwMBF1c能够显著提高转基因拟南芥和马铃薯的耐旱性。

白龙江濒危树种大果青杄优势种群种间关系

【目的】揭示白龙江流域大果青杄Picea neoveitchii天然林群落乔木层、灌木层、草本层主要物种的种间关系,探讨群落伴生种间相关性及的资源竞争压力,以期为大果青杄保护策略提供科学的理论依据。【方法】通过典型样地调查,采用方差比率、Pearson相关检验和Spearman秩相关检验方法,分析大果青杄群落乔、灌、草3个层次优势种群的种间相关性。【结果】大果青杄群落内共出现植物35科62属78种,其中乔木层6科10属14种,灌木层21科32属37种、草本层13科23属27种。乔木层大果青杄为第一优势树种,其次为华山松、油松等。灌木层中优势种群有蒙古栎、刺叶高山栎、茶藨子,其次为毛叶水栒子、毛黄栌、光果莸、堆花小檗、小叶鼠李等。草本层的优势种群为青绿薹草和东方草莓,其次为野棉花、牛尾蒿、蒙古风毛菊、豨莶、车前等。大果青杄群落乔木层总体联结性呈显著的正联结,灌木层和草本层种间总体联结性呈不显著正联结,结合Pearson相关检验和Spearman秩相关检验的结果,乔、灌、草3个层次种间相关性均不存在显著负相关情况,不显著种对数均大于显著种对数,总体趋于不显著负相关。【结论】大果青杄群落内物种对资源环境竞争趋于平稳,乔、灌、草3个层次物种间相关程度较弱,物种呈偶然聚合,群落演替处于较高阶段,结构稳定性较强。

青海大通河流域北山林区青杄林经营模式和技术

本文通过对青海大通河流域北山林区青杄(Picea wilsonii)林群落系统的调查,综述了北山林区青杄林区概况、现状和经营技术模式选择,并提出健康经营模式和改进技术措施。这为提高青海大通河流域青杄林的经营水平和经营效益提供借鉴和建议。

山西青杄育苗技术研究

青杄为云杉属常绿针叶乔木,在山西多为天然次生林,主要分布于关帝山、五台山、管涔山等地区,是山西省主要森林树种之一。介绍了青杄的播种育苗、留床苗木和移植苗木管理技术。

青杄均一化cDNA文库构建及EST序列分析

以青杄花粉和针叶为材料,将青杄全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了其非剪切型全长cDNA原始文库,利用基因组DNA饱和杂交技术对原始cDNA文库进行均一化处理,构建青杄的均一化全长cDNA文库。文库的总库容量为1.1×106CFU/mL,平均插入片段长度大于1.0 kb,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,青杄高丰度表达基因EF1-α在均一化cDNA文库中的表达量下降了约41倍。接着对文库中随机的5 144个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressedsequence tag)序列为5 144条,经拼接共获得单一基因(unigene)为2 717个,其中包括片段重叠群(contig)628个和单一EST序列(singlet)2 089个。NCBI同源比对分析表明,其中1 887个序列unigenes获得分子功能注释,这些EST涉及细胞生长、信号转导、转录、抗逆、能量代谢等功能。这些数据有助于对青杄的相关功能蛋白及分子机制开展进一步的研究。

自组织特征映射网络在芦芽山自然保护区青杄林分类和排序中的应用

采用自组织特征映射网络(SOM)对芦芽山自然保护区青杄林进行数量分类和排序。结果表明:SOM将60个森林样地划分为8个群落类型,各类型在排序图上都有其分布范围和界限,且群落结构、物种组成差异明显,说明分类和排序结果合理,可较好地揭示群落间的生态关系;通过环境因子梯度的可视化方法,确定海拔、坡位和坡度是影响该地区青杄林生长和分布的主要因子,揭示群落、物种及植被分布和环境因子的关系。结果表明SOM网络适用于表征群落生态特征及探索群落和环境相互关系的研究,将其应用于自然保护方面,将有利于对不同植被类型进行分类和管理。

青杄PwPSAF基因的克隆与组织表达分析

PSAF是绿色植物光系统Ⅰ反应中心F亚基,在光合作用电子迁移过程中起着重要作用。以青杄cDNA文库为模板,根据PwPSAF的EST序列设计引物,进行5'-RACE和3'-RACE试验,以获得青杄PwPSAF的末端序列,经过与EST序列进行拼接获取青杄PwPSAF的全长cDNA序列。基于其氨基酸序列,利用Expasy tools、DNAMAN、ClustalX和MEGA等工具,进行理化性质、二级结构和三级结构的生物信息学分析。结果表明:PwPSAF是一个由253 aa组成的蛋白质,理论分子量为27.04 kDa,等电点为9.57,预测蛋白有2个跨膜区域,蛋白质的C端具有保守的结构。RT-qPCR试验显示PwPSAF主要在青杄的针叶中表达。在种子萌发过程中吸胀期(0～ 2天)表达量最高,在4天时表达量降低,随着子叶的不断长出,其表达量又逐渐增高。在干旱和盐胁迫下,针叶中的PwPSAF的表达量被大幅下调。研究结果显示PwPSAF在青杄种子萌发及非生物逆境胁迫下的光合过程中起着重要作用。

PwEXP1在青杄种子萌发及逆境响应中的表达特征

采用RACE-PCR技术,从青杄c DNA文库中克隆得到1个青杄Pw EXP1基因,其c DNA全长为1 186 bp,含777 bp的完整开放阅读框,编码259个氨基酸。生物信息学分析发现其理论分子量为27.90 k Da,等电点(p I)为8.07,N端有8个半胱氨酸残基,C端4个色氨酸残基,中部1个HFD结构域,具有扩展蛋白的典型结构。RT-q PCR试验显示Pw EXP1在青杄针叶中相对表达量较高。在种子萌发过程中,未开始萌发的种子表达量较低,萌发第2天和第4天表达量开始升高,萌发6天后达到较高水平。在逆境胁迫下,Pw EXP1在青杄根和叶中的表达模式不同。Na Cl和低温、高温胁迫均能增加Pw EXP1在根中的表达水平;PEG处理的渗透胁迫下,Pw EXP1在根中表达特征呈现前期下调、6 h后上调,而在叶中则在胁迫3 h和6 h时上调、9 h和12 h时下调、24 h时重新上调;在ABA处理后,Pw EXP1在根和叶中均表现下调。推测Pw EXP1在青杄种子萌发和逆境响应中发挥作用。

青杄生长素抑制蛋白基因PwARP-1的克隆及表达分析

从青杄的cDNA文库中筛选出一个生长素抑制蛋白基因PwARP-1(Auxin-repressed protein 1),并通过RACE-PCR技术获得PwARP-1 cDNA全长。生物信息学分析显示,PwARP-1基因编码155个氨基酸残基的蛋白,分子量为17.1 kD,理论等电点为10.07,富含无规则卷曲。以多年生青杄和青杄幼苗为研究材料,通过RT-qPCR技术检测PwARP-1的组织特异性表达、激素的响应模式及种子萌发过程中的表达量模式。结果表明,PwARP-1在青杄各个组织中均有表达,在花粉中表达量最高,在种子中的表达量最低。PwARP-1在种子萌发过程中表达量呈先上升,在第10天表达量达到最高后开始下降。进一步试验表明,PwARP-1能响应多种逆境胁迫和激素处理。在赤霉素(GA)和生长素(IAA)处理下PwARP-1的表达量被抑制。在干旱胁迫和油菜素内酯(BR)激素处理下PwARP-1的表达量逐渐升高,而在在盐胁迫、茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)等激素处理下PwARP-1的表达量先下降后上升。这些结果显示PwARP-1可能参与了植物种子萌发、多种逆境胁迫和激素响应过程。

青杄干旱诱导基因PwWDS1的cDNA分离与表达分析

植物干旱诱导蛋白是植物体在遭遇干旱胁迫或缺水胁迫时被诱导表达或者表达量被上调的一类蛋白,通过直接作用或者调节其他基因的表达来使植物适应干旱逆境（Desclos et al.,2008;Urao et al.,1994）。这类蛋白在功能上分为2类：其一为功能蛋白,在细胞内直接参与保护作用。

甘肃兴隆山保护区青杄群落结构分析

以甘肃兴隆山青杄群落为对象,分析了其群落特征和种群空间分布格局。在植物区系地理成分上,该群落属的分布类型以温带性质居多。生活型以高位芽植物最多。群落层次分为乔木层、灌木层、草本层和苔藓层,亦有层间植物伴生。除了样地4为聚集分布外,其他3个样地的青杄种群均为均匀分布。造成均匀分布的原因是青杄的生物学特性和林下华西箭竹生长状况共同引起的。不同海拔、不同林型的4个样地的聚集强度大小依次为:样地4>样地2>样地3>样地1。聚集强度的变化表明,种群年龄和苔藓层厚度同样影响空间分布格局。

青杄PsbO基因cDNA序列克隆及生物信息学分析

利用RACE技术从已有的青杄均一化cDNA文库中克隆得到青杄(Picea wilsonii)PsbO基因cDNA的全长,并用生物信息学的方法对该cDNA的核苷酸序列、氨基酸序列的相似性,及编码蛋白PwPsbO的理化性质、亲水性/疏水性、二级和三级结构,PwPsbO基因进化树等进行了预测和分析.采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,测定了青杄不同组织中的PsbO基因的相对表达水平.结果发现:青杄PsbO基因编码346个氨基酸,预测相对分子质量为36.6 kD,理论pI值为5.29,属于可溶性蛋白.二级和三级结构预测表明其含有较多的α螺旋、β折叠和随机卷曲结构.RT-qPCR发现该基因在青杄针叶和茎中表达量最高.这些结果为青杄中PsbO基因的初步功能研究奠定了基础.

青杄PwWrbA基因克隆及表达分析

色氨酸阻遏结合蛋白(tryptophan repressor-binding protein,WrbA)是一种重要的抗氧化酶类,参与了多种逆境反应。笔者通过RACE-PCR的方法克隆得到青杄WrbA基因的cDNA全长,共1 045 bp,编码区651 bp,编码203个氨基酸。利用生物信息学工具对其进行理化性质、二级结构和三级结构的分析,该蛋白理论分子质量21.80 ku,pI值6.43,N端11—15位氨基酸和C端112—165位氨基酸是FMN结合位点。荧光定量PCR和半定量RT-PCR发现青杄PwWrbA在各组织中都有表达,但在针叶中表达量最高。同时,PwWrbA在NaCl和ABA胁迫处理后表达量升高,H2O2也会影响其表达的改变,H2O2处理6 h后表达量上调。因此,PwWrbA是一个新的WrbA基因,推测其可能在青杄逆境胁迫应答中发挥作用。

青杄针叶多酚超声提取工艺的优化

以青杄针叶为试材,以乙醇为提取剂,采用超声提取法,通过正交实验研究优化了青杄针叶总多酚的最佳提取工艺。结果表明:影响青杄针叶中总多酚提取的因素大小依次为:料液比>超声功率>超声温度>超声时间,最优的提取工艺是料液比1∶60g/mL,超声功率为350W,超声温度为45℃,超声时间35min,在此条件下,多酚提取率为34.72%。

青杄功能性状及其在各器官间分配格局的时空变化

为研究青杄在不同环境和发育阶段的适应性和生存策略,以关帝山典型森林分布区的青杄(Piceawilsonii)为对象,分析其叶片鲜干比、叶面积、叶绿素和C、N、P含量等重要功能性状在不同年龄(5、15、25、35、45a)和不同海拔梯度(1760、1820、1880、1940、2000m)上的变化,以及C、N、P在各器官间分配格局随年龄和海拔的时空变化。结果表明:1)随树龄的增加,青杄叶面积、叶鲜干比呈增大趋势,叶P和根P含量呈下降趋势,叶有机碳含量下调,但根有机碳在上调。2)随海拔增加,叶绿素、叶面积显著增加,叶有机碳呈下降趋势,而根有机碳在增加。叶、枝、根中的N、P含量均呈先增加后减小趋势,相比之下,N、P随海拔的变化较有机碳更为显著。3)随树龄增加,C、N、P在各器官间分配格局表现为:P在幼年时于叶、根中分配比例相对较大,成年时主要集中在枝中。在研究的5~45a范围内,N分配呈叶>枝>根的稳定格局,未随年龄而显著变化。有机碳则在各器官呈近乎均匀分配的基础上随年龄增加根中比例略有增大,相反叶中比例略有下降。C、N、P并未随海拔增加呈现各器官间分配格局上的显著变化。青杄各功能性状随年龄和海拔变化并通过在各器官间相互关联和协调分配来增强其生态适应性。

青杄分子伴侣PwTCP-1基因的克隆及表达分析

分子伴侣TCP-1在调节植物生长发育过程中具有重要作用,但在林木生长发育及对非生物逆境胁迫响应机制方面的研究较少。从青杄c DNA文库中筛选出1个分子伴侣PwTCP-1(T-complex polypeptide 1)片段,通过RACE-PCR技术获得PwTCP-1的末端序列,经过与EST序列拼接,获得PwTCP-1c DNA全长序列。使用clustalx、Mega5.0、DNAMAN和Expasy等工具对PwTCP-1的理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析。结果显示,PwTCP-1c DNA全长为2024 bp,开放阅读框1 605 bp,编码534个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子质量为59.2k Da,理论等电点为6.12,富含α-螺旋。通过RT-q PCR技术检测了PwTCP-1组织特异性表达、激素响应模式及在种子萌发过程中表达量变化。结果表明:PwTCP-1在青杄各个组织中均有表达,在花粉中表达量最高,在茎中表达量最低;PwTCP-1表达量随着种子萌发先上升,在第4天达到最高,之后缓慢下降。PwTCP-1能响应多种激素处理。油菜素内酯(brassinolide,BR)和赤霉素(gibberellin,GA)分别处理后,PwTCP-1的表达量均显著降低,而茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)处理后该基因表达量极显著升高。这些结果显示,PwTCP-1可能参与植物种子萌发过程并响应了多种激素反应过程。

青杄花粉保存方法试验研究

通过对不同保存方式下保存2～4年的同株青杄花粉生活力测定，结果表明：室温保存的青杄花粉效果较差，2年后花粉活力只有11．5％；低温保存条件下，随着保存时间的延长，花粉的生活力虽有下降，但不太明显，在4℃下和-20℃下保存青杄2年后，其生活力仍然在78％和80％左右，-20℃下保存的青杄花粉生活力较4℃稍强。因此，在-20℃条件下较长时间保存云杉花粉效果更为理想。

青杄中sPPa1的cDNA序列克隆及其生物信息学分析

以青杄(Picea wilsonii)均一化cDNA文库为模板,通过RACE方法克隆得到青杄PPa1基因cDNA全长,对该cDNA序列、核苷酸序列的相似性、理化性质、疏水性、二级结构、三级结构及是否跨膜进行了分析预测;进行了多序列比对并构建了系统树,同时对PPa1在青杄各组织中的表达量进行了检测。结果表明:青杄PPa1基因共由216个氨基酸组成,分子量为24.55 kD,理论PI为5.83,属可溶性蛋白;二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲和β-折叠构成;PPa1在青杄花粉中表达量最高。研究为进一步研究青杄PPa1的功能奠定了基础。

祁连山东部青杄年内径向生长动态对气候的响应

树木径向生长对气候因子的响应是树轮气候学的基础。在我国西北地区,虽然已有大量的树轮-气候响应研究,但是响应分析多基于数理统计结果,缺乏对树木生长过程的理解。基于此,于2013年到2015年在祁连山东部吐鲁沟国家森林公园内通过Dendrometer连续监测了树轮气候重建中常用树种青杄的径向生长,通过平均值法提取2013到2015年生长季内不同时间尺度(1天、7天、10天)的平均径向生长量及对应时间段的平均气候状况。不同时间尺度径向生长量和气候因子的相关分析结果表明,时间尺度的延长削弱了树干水分昼夜变化的干扰,但水分仍然是青杄径向生长的限制因子。为了进一步分析青杄径向生长与气候关系随时间的变化情况,以31天为窗口将日径向生长量与气候要素每隔一天进行滑动相关,结果显示:5、7月青杄的径向生长与降水的关系稳定,都呈显著正相关,但是6月降水的年际变率较大,导致树木可利用水分的变幅也较大,因而树木径向生长与6月水分的响应关系不稳定,存在较大的年际差异,而这可能是一些树轮-气候响应研究中轮宽与6月降水关系不显著的原因。

采种母树和育苗地海拔对大果青杄苗木播种育苗的影响

大果青杄是我国特有种,国家二级珍稀濒危植物,天然更新困难,人工繁育是恢复种群的重要手段。本文通过对大果青杄不同采种母树的种子、不同海拔的苗圃育苗实验,得出:不同母树种子以及海拔对大果青杄育苗具有相关性,树龄150年左右的母树其种子出苗率高,海拔在1 678 m的地方是苗木的适生区。