青枯雷尔氏菌GMI1000菌株龙胆酸1,2-双加氧酶活性中心关键氨基酸残基的鉴定(英文)

生物信息学分析表明,位于青枯雷尔氏菌GMI1000菌株的染色体上的读码框RSc1087可能编码一个龙胆酸1,2-双加氧酶.本研究克隆、表达了该基因,并通过亲和层析对该基因表达产物进行了纯化.酶学测试结果证实,该基因编码的正是龙胆酸1,2-双加氧酶.SDS-PAGE结果表明,该酶亚基分子量约为38×103.基因的定点突变揭示105位、107位和146位组氨酸残基是该酶活性中心的关键氨基酸残基.

番茄青枯雷尔氏菌的强致病力与无致病力菌株生长竞争关系的研究

在单独和混合培养条件下,研究了番茄青枯雷尔氏菌的强致病力(RV)与无致病力菌株(RA)的生长能力的差异.单独培养时,24h前无致病力菌株的菌体生长量超过强致病力菌株,24h后强致病力菌株菌体生长量超过无致病力菌株,12h时无致病力菌株的生长速率是强致病力菌株的5.6倍,60h时无致病力菌株的菌量仅为强致病力菌株的0.37倍.混合培养时,混合比例RV RA<1时,两种菌株都呈正增长,但后者比前者增长快,当混合比例RV RA≤1时,强致病力菌呈负增长(-119.57%～-33.57%),无致病力菌呈正增长(84.50%～285.50%).随着RV RA值升高,增长率呈升高的趋势.上述结论表明:无致病菌株在一定的时间内具有高于强致病力菌的生长能力,当与强致病力菌混合时,能较快成为优势种群,这可能是人工大量施用无致病力菌株时,能有效地保护番茄植株在生长初期免受青枯病的危害,在短期内起到一定的防治效果的原因所在.但随着时间的延长,强致病力菌株又重新成为优势种群,这可能是导致无致病力菌防效下降的原因之一.

高效离子交换色谱法分析青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株的异质性

【目的】研究青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)Tn5转座子突变菌株的异质性,筛选出无致病力高效生防菌株。【方法】利用已构建的青枯雷尔氏菌致病力参考指标"弱化指数(attenuation index,AI)"和接种番茄植株的生物测定法对60株供试的青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株进行致病力测定;利用高效离子交换色谱法研究不同致病力突变菌株的色谱行为异质性;构建色谱效价指数(chromatography titer index,CTIi),CTIi=Si/(S1+S2+S3)×100%(i=1、2或3;S1、S2和S3分别对应P1、P2和P3的峰面积),测定不同致病力青枯雷尔氏菌突变菌株的CTIi值,用皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient,PCC)分析色谱效价指数与突变菌株的致病力和青枯病害防治效果的相互关系。【结果】基于AI值和生物测定结果,青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种不同致病力类型:强致病力、无致病力和中间型。强致病力菌株共33株,其AI值介于0.49—0.63,接种番茄15 d,植株发病率为66.33%—100%;无致病力菌株共有20株,其AI值介于0.78—0.89,接种番茄15 d,植株发病率为0;中间型菌株共有7株,其AI值介于0.68—0.73,接种番茄15 d,植株发病率为24.17%—45.92%。20株无致病力突变菌株对番茄青枯病的防治效果测定结果显示,防治效果介于16.68%—92.45%,菌株T831防治效果最好,达91.74%,其次是菌株T780,防治效果为87.51%,菌株T497防治效果最差,为16.68%。不同致病力青枯雷尔氏菌的高效离子交换色谱分离结果显示,青枯雷尔氏菌经高效离子交换色谱可以分离出P1(出峰时间为0.6 min)、P2(出峰时间为4.4或4.5 min)和P3峰(出峰时间为5.9或6.0 min);强致病力菌株和无致病力菌株均具有3种不同峰类型:单峰、双峰和3个峰,强致病力菌株的主峰为P3峰,无致病力菌株的主峰为P1峰,中间型菌株有双峰和3个色谱峰两种类型;强致病力菌株中CTI3为100%的菌株,致病力最强,诱导番茄植株发病率均达85%以上,CTI3<100%的菌株,接种后番茄植株发病率介于66.33%—84.14%;无致病力菌株中CTI1达100%的菌株,其防治效果高,均达到80%以上,CTI1<90%的菌株,其防治效果低,介于16.68%—63.62%;CTI3与突变菌株致病力呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.62;CTI1与无致病力突变菌株的防治效果呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.80。【结论】青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种致病力类型,不同致病力菌株的色谱行为不同。构建的色谱效价指数CTI1可用于快速筛选出无致病力高效生防菌株,CTI3可作为青枯雷尔氏菌致病力的参考指标。

青枯雷尔氏菌TN5转座子无致病力突变株插入位点的鉴定与分析

利用TN5插入强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91,获得突变株FJAT-t582和FJAT-t583。菌落形态观察及弱化指数测定结果表明,突变株FJAT-t582和FJAT-t583表现为典型的无致病力菌落形态,且弱化指数均在0.8以上。利用卡那霉素抗性基因特异性引物从突变菌株FJAT-t582和FJAT-t583中均扩增出片段大小为681bp的条带,而野生型菌株FJAT-91未扩增出任何条带,说明TN5转座子已插入其基因组中。对这2株无致病力突变株进行反向PCR测序和序列比对,分析鉴定出插入位点在编码putative diguanylate phosphodiesterase基因和Ⅲ型效应蛋白基因中,推测这2个基因的突变致使强致病力菌株表现出无致病力特征。

高效离子交换色谱法分析青枯雷尔氏菌无致病力epsD突变菌株的异质性

利用高效离子交换色谱(HPIEC)技术结合形态观察和胞外多糖(EPS)含量测定,比较分析青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT-91⊿epsD与强致病力出发菌株FJAT-91及自然致弱的无致病力菌株FJAT-1458的异质性。结果表明,菌株FJAT-91⊿epsD与菌株FJAT-91在菌落和菌体形态上均有明显差异,与菌株FJAT-1458的形态相似。胞外多糖含量测定结果表明,菌株FJAT-91⊿epsD的EPS含量((12.64±1.46)μg/mL)显著低于菌株FJAT-91((30.49±2.97)μg/mL),与菌株FJAT-1458的EPS含量((11.30±1.38)μg/mL)相当。高效离子交换色谱分离结果表明,菌株FJAT-91、FJAT-91⊿epsD和FJAT-1458形成的色谱峰个数和保留时间不同,菌株FJAT-91只有单一色谱峰P3,保留时间为6.04 min;菌株FJAT-91⊿epsD有P1和P2两个色谱峰,保留时间分别为0.59 min和4.62 min;菌株FJAT-1458只有单一色谱峰P1,保留时间为0.59 min。对不同色谱峰回收培养,并对回收培养后的菌株进行致病力鉴定。结果表明,番茄植株接种菌株FJAT-91-P3后第4 d开始发病,第10 d发病率达100%;植株接种菌株FJAT-91⊿epsD-P2后第9 d开始发病,第20 d发病率达100%;植株接种菌株FJAT-1458-P1和菌株FJAT-91⊿epsD-P1后,在观察期内均未发病。研究结果可为利用菌株FJAT-91⊿epsD防治作物青枯病提供理论依据。

青枯雷尔氏菌胁迫对烟草植株抗氧化酶系活性的影响

以青枯雷尔氏菌RS-1403作为外源微生物，研究不同浓度青枯雷尔氏菌胁迫对烟草植株叶片PPO、POD、SOD酶活性的影响。结果表明：PPO和POD酶活性总和显著高于对照，而SOD酶活性总和除了处理2（接种浓度为2．35×10^4CFU／mL）外，其余的各个处理的均低于对照。烟草植株的根部、茎部和叶片的POD、PPO和SOD酶活性总和明显高于对照处理，并且其酶活性达到高峰的时间有所不同。胁迫接种5d后，烟草植株叶片和茎部的POD酶活性和对照处理的比值最大，胁迫接种10d后，烟草植株根部POD酶活性比值最大。烟草植株叶片和根部在接种15d后，PPO酶活性和对照处理的比值达到最大，茎部PPO酶活性在接种5d后比值最大。接种20d后，处理烟草植株叶片和茎部的SOD酶活性和对照处理的比值达到最大，接种后25d，根部SOD酶活性比值最大。

番茄青枯雷尔氏菌强致病力菌株变异的研究

为研究番茄青枯雷尔氏菌强致病力菌株的变异,探索了继代培养、在 NB 培养基上不同时间培养、不同 pH 处理7 d 和15 d、不同温度处理1 h 后对强致病力菌株变异的影响.结果表明：随着继代培养的培养代数增加,平均弱化指数成增大趋势,在第10代出现了无致病力菌株；在 NB 培养基上培养15 d 时,强致病力菌株已完全转化为不确定菌株和无致病力菌株,在培养30 d 时,强致病力菌株几乎完全转化为无致病菌株；pH7．0时,处理7 d 和15 d 后,强致病力菌株比例均为最大,分别为93．33％和92．22％,pH5．8时,强致病力菌株比例最低,分别为46．67％和31．11％；用不同温度处理强致病力菌株发现,温度50℃时,菌株死亡,温度40℃时,活菌数显著低于其他（4～30℃）处理,强致病力菌株比例为4~40℃所有处理中最低.

青枯雷尔氏菌致病机制及其相关基因的研究进展

阐述青枯雷尔氏菌致病基因以及它们之间的相互调节。由于青枯雷尔氏菌的复杂性,进而发展了许多青枯雷尔氏菌分子鉴定技术,并且对青枯雷尔氏菌的鉴定逐渐走向快速、便捷和灵敏高的趋势。青枯雷尔氏菌基因组约5.8Mb,具有高(G+C)含量和约5 120个可能的编码基因;它是由3.7Mb的染色体和2.1Mb的大质粒所组成,主要的致病因子有Ⅲ型hrp分泌系统产物、胞外多糖、细胞壁降解酶(包括果胶质酶以及纤维素酶等),其涉及的基因主要包括hrp基因簇、avr基因、毒性基因;青枯雷尔氏菌通过Ⅲ型分泌系统(T3SS)、II型分泌系统(T2SS)等分泌系统将多种毒性因子输送到胞外使寄主植物致病。同时,T3SS和T2SS之间也是相互影响的。上述致病因子的协调作用是由一个复杂的网络调节系统控制的,并以PhcA调节基因的启动和转录为核心,自动而精密地调节有关致病基因的表达及关闭,从而控制细菌的生长状态。

无致病力青枯菌FJAT-a RS01的固态发酵及对茄果类蔬菜青枯病的防治效果

利用无致病力青枯菌研发植物疫苗防治青枯病是植物病害防治研究中的新途径。无致病力青枯菌FJAT-aRS01具有防效高和稳定遗传等特性。为了进一步开发利用该菌株,本研究以巨菌草渣为其主要发酵培养基,通过正交试验优化培养基配方和发酵条件,固态发酵FJAT-a RS01,并进行质量检测。结果表明,优化后菌株FJAT-aRS01固态发酵培养基配方为巨菌草渣36.36%、玉米粉27.27%、米糠27.27%和稻壳9.09%;发酵条件为接种量15%(10^(8)CFU/mL),料水质量比为1:0.8,装袋量为150 g/袋,发酵时间为48 h;在该发酵条件下,FJAT-aRS01的固态发酵物活菌数可达到1.80×10^(9)CFU/g,其营养成分含量超过微生物肥料的国家标准(NY/T 798-2015);FJAT-a RS01固态发酵物浸提液的50倍稀释液能促进番茄种子萌发,其100倍稀释液能促进辣椒和茄子种子萌发;在栽培基质中添加质量百分比≤15%的FJAT-aRS01固态发酵物能促进植株生长,添加质量百分比25%的FJAT-a RS01固态发酵物对于番茄、辣椒和茄子青枯病的防效均达75%以上。综上所述,无致病力青枯菌FJAT-aRS01的固态发酵物具有促生防病功能,具备良好的应用前景。

青枯雷尔氏菌龙胆酸1,2-双加氧酶基因的克隆、表达和酶性质的研究(英文)

本研究克隆、表达了青枯雷尔氏菌GMI1000菌株中编码龙胆酸1,2-双加氧酶的基因,并通过亲和层析对该酶进行了纯化,SDS-PAGE结果表明该酶亚基约为38kDa。该酶的最适反应温度和最适pH分别为30℃和7.5。该酶的Km为56μmol/L,pI为4.6～4.8。纯化后的龙胆酸1,2-双加氧高度不稳定:4℃下放置72h即失去85%的酶活。甘油和β-巯基乙醇可稳定该酶酶活,在添加10%(体积比)甘油至酶液(50mmol/L,pH7.3的磷酸盐缓冲液保存)后,-20℃保藏2周后均能检出明显的酶活。0.1～1mmol/LFe2+可以激活或者稳定该酶的酶活。Na+,K+,Mg2+和Ca2+(分别为1～2mmol/L)对该酶的酶活无明显的影响。Mn2+,Zn2+和Fe3+的添加量超过2mmol/L时,酶活急剧下降。1mmol/L的Cu2+即使该酶失去酶活。

青枯病生防菌ANTI-8098A菌株发酵过程氨基酸变化动态的研究

青枯病生防菌ANTI- 80 98A发酵过程的氨基酸测定结果表明 :ANTI - 80 98A的氨基酸代谢消耗发生在 0～ 2 4h ,消耗了 87.0 7%的总氨基酸 ;代谢累积发生在 2 4～ 4 8h ,4 8h的总氨基酸为 0h的 1 .6 7倍。在 1 7种测定的氨基酸中 ,1 6种氨基酸都表现出与总氨基酸类似的变化趋势 ,丝氨酸在 32h有最大值 ;根据含量大小可分为 3类 ,根据变异系数大小也可分为 3类 ,其中谷氨酸含量 ,丝氨酸变异系数最大。氨基酸种类特性的聚类分析结果表明 :当λ =1 7.5 0时 ,氨基酸变化可分为 4大类。发酵时间的聚类分析结果表明 :当λ=2 5 .36时 ,可分为 3大类 。

内生枯草芽孢杆菌B-001菌株抗菌肽纯化与性质

An antagonistic peptide,H16,produced by endophytic Bacillus subtilis B-001 was purified via ammonium sulphate precipitation,DEAE-Sepharose FF chromatography,FPLC Phenyl FF chromatography and HPLC C18 chromatography.The peptide showed strong antagonistic activity to Ralstonia solanacearum.LC-ESI-MS analysis showed molecular weight of the peptide was 7 367.4 Da,which was the same with that by SDS-PAGE.It was thermostable and not sensitive to proteinases.

荧光素酶标记无致病力青枯雷尔氏菌的生物学和定殖特性

为示踪青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum无致病力菌株FJAT1458在番茄植株及根际土壤中的定殖特性,采用电击法对菌株FJAT1458进行荧光素酶(luciferase,LUC)基因标记,并于室内采用生测法测定标记菌株的生物学特性、遗传稳定性、致病力及在番茄植株和根际土壤中的定殖能力。结果表明,成功将luc基因整合至无致病力菌株FJAT1458染色体上,标记菌株FJAT1458-LUC发出强烈的荧光,且PCR扩增出1612 bp的luc基因片段;与野生型菌株FJAT1458相比,标记菌株FJAT1458-LUC的生长明显滞后,培养8h之后标记菌株FJAT1458-LUC的OD600nm值均小于野生型菌株FJAT1458;且标记菌株FJAT1458-LUC连续传代20次后菌体浓度显著增加,发光菌体比例显著降低,LUC活性和luc基因表达量均随着传代数增加而显著降低;标记前、后菌株FJAT1458的弱化指数分别为0.90和0.89,且接种番茄植株30 d均未引起植株发病。标记菌株FJAT1458-LUC能在番茄根际土壤、根及茎中定殖,定殖数量呈现先升高后降低的趋势,定殖量最大值分别出现在接种后3、5和5 d;接种后9 d和12 d在番茄茎和根中未检测到该菌株。表明青枯雷尔氏菌无致病力菌株FJAT1458成功标记luc基因后仍能在番茄植株及根际土壤中定殖,具有良好的生防潜力。

青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析

利用青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)无致病力菌株防治番茄青枯病具有很好的应用潜力。作者通过分离筛选自然弱毒株、60Co辐射诱变和EZ-Tn5插入诱变,分别获得3、12和40株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株。经盆栽番茄苗致病性检测,15 d后均未发病,证实均为无致病力青枯雷尔氏菌。进一步对番茄青枯病的防治试验表明,从番茄青枯病发病田块分离的无致病力突变菌株FJAT1458的防治效果最好,防效达100%。该菌株能定殖番茄植株根系土壤、根部和茎部,定殖数量均表现为"先增后减"的趋势,并且接种浓度越大、苗龄越小,定殖数量越大。从构建的防效模型可以看出,不同接种浓度条件下,植株发病率随时间变化符合的回归方程不同,相关系数R值也不同,接种浓度越大,R值越小。本研究获得的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT1458对番茄青枯病具有很好的防病效果。

生防菌对青枯雷尔氏菌强致病力和无致病力菌株生长竞争的影响

采用共培养法研究了不同温度下青枯雷尔氏菌强致病力菌株F-01-V与无致病力菌株F-01-A之间的生长竞争、生防菌ANTI-8098A胞外物质对F-01-V和F-01-A生长的影响以及对F-01-V与F-01-A之间生长竞争关系的影响。结果表明,在15、20、25、30和35℃,菌株F-01-V、F-01-A单独静置培养48h后,F-01-V活菌数的增长率最高可达123.7%,F-01-A的活菌数下降,最大降幅为60.7%;当F-01-V与F-01-A等量混合培养时,F-01-V能继续增长,但48h后的增长率不如单独培养时的高,F-01-A的生长受到促进,使得这两个菌株的活菌数之比(F-01-V/F-01-A)与混合前的比值(0.97)相近;生防菌胞外物质对F-01-V有较强的抑制作用,抑制率与温度呈正相关,对F-01-A具有促进生长的作用,促长率也与温度呈正相关;生防菌胞外物质对F-01-V的抑制作用和对F-01-A的促进生长作用,导致在生防菌液、F-01-V与F-01-A共存的环境中,F-01-V与F-01-A之间的生长竞争向着有利于F-01-A的方向发展,使F-01-A成为优势菌株,特别是在30℃以上的温度下,F-01-V/F-01-A小于0.01,F-01-A的优势极为明显。

青枯雷尔氏菌Tn5转座子无致病力突变株在番茄根部的定殖特性

为筛选防治番茄青枯病的优良生防菌株,本研究以弱化指数、胞外多糖含量和盆栽苗番茄发病率为指标确定20株经形态初步判定为无致病力的青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum Tn5突变菌株的致病性,测定其在番茄根部的定殖数量,并于显微镜下观察其定殖特性。结果表明,供试的20株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的弱化指数均大于0.75,胞外多糖含量介于1.59~16.68µg/mL之间,显著低于强致病力菌株FJAT-91,接种40 d番茄植株未出现青枯病症状;20株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株均能在番茄根部定殖,定殖数量呈先上升后下降的趋势,其中菌株T659的定殖数量最大,定殖时间最长,分别为2.86×10^(6) CFU/g和35 d;透射电镜观察发现,青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株T659从番茄植株根部表皮细胞中侵入,然后进入维管束厚壁细胞,并在维管束细胞中大量繁殖和定殖,但未引起番茄根部细胞结构病理变化。表明供试的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株T659的定殖能力最强,具有良好的生防潜力。

青枯雷尔氏菌无致病力hrpB突变菌株的纯化分离及其异质性研究

获得纯度高的青枯雷尔氏菌无致病力菌株,是研发青枯病植物疫苗和防治青枯病害的一种新途径。作者以青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91为出发菌株,通过对hrpB基因敲除,获得无致病力突变菌株FJAT-91ΔhrpB。高效离子交换色谱分离结果表明:FJAT-91和FJAT-91ΔhrpB色谱峰型不同,主要表现在峰的保留时间上,FJAT-91只有单一色谱峰,保留时间为6 min;FJAT-91ΔhrpB有P_1和P_2 2个色谱峰,保留时间分别为0.6 min和4.5 min。利用高效离子交换色谱对FJAT-91ΔhrpB进行纯化,获得只有P_1峰的高纯度菌株FJAT-91ΔhrpB-P。FJAT-91ΔhrpB和FJAT-91ΔhrpB-P与其出发菌株FJAT-91的菌落和菌体形态差异明显。致病力测定结果表明:FJAT-91接种4 d番茄植株开始发病,10 d发病率达100%;FJAT-91ΔhrpB和FJAT-91ΔhrpB-P接种20 d均未发病。防效试验结果表明:纯化后的菌株FJAT-91ΔhrpB-P对番茄青枯病的防效(81.64%)比未纯化FJAT-91ΔhrpB防效(61.04%)提高了33.75%。本研究获得一株高纯度的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT-91ΔhrpB-P具有良好的生防潜力。

植物疫苗在蔬菜栽培中的应用实例

目前,植物疫苗在生产上应用较多的是激活蛋白、氨基寡糖素、枯草芽孢杆菌等,能使植物免遭病害或减轻病害,诱导产生植物抗性、抵抗病原菌入侵及抑制病原微生物生长,主要包括弱毒或无毒株系疫苗、蛋白类疫苗、活菌疫苗、寡糖疫苗、其他代谢产物及转基因植物疫苗。番茄植株接种青枯病植物疫苗菌株F J A T-1458（青枯雷尔氏菌无致病力菌株）,接种后番茄根系土壤微生物脂肪酸组成及含量发生明显变化。