Cu^(2+)、Pb^(2+)对青海湖裸鲤的急性毒性效应及相关基因表达的影响

为了研究Cu^(2+)、Pb^(2+)对青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)的急性毒性效应及相关基因相对表达水平的变化,实验以静态暴露和qPCR法分别进行毒性试验及检测青海湖裸鲤鳃、肾脏和肝脏中Nrf2(核因子NF-E2相关因子)、Keap1(Kelch样环氧氟丙烷相关蛋白)、MT(金属硫蛋白)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、Hsp90(热休克蛋白90)、Hsp70(热休克蛋白70)、iNOS(诱导型一氧化氮合酶)和COX-2(环氧化酶2)的相对表达。毒性实验结果表明,Cu^(2+)(0.1、0.2、0.5、1和2 mg/L)对1龄青海湖裸鲤安全浓度为0.03 mg/L;Pb^(2+)(0.5、1、2.5、5和10 mg/L)安全浓度为0.1 mg/L;Cu^(2+)+Pb^(2+)的复合胁迫对青海湖裸鲤具有拮抗作用。在低于安全浓度Cu^(2+)、Pb^(2+)与Cu^(2+)+Pb^(2+)复合胁迫下,检测基因表达水平结果显示,Nrf2在Cu^(2+)和Pb^(2+)胁迫12 h时表达上调,Keap1在Cu^(2+)、Pb^(2+)与Cu^(2+)+Pb^(2+)复合胁迫12 h的肾脏中显著下调,表明Nrf2-Keap1两者之间存在负调控作用。各浓度条件下,MT的表达在鳃和肝脏中均下调,TNF-α的表达在鳃中上调。在Cu^(2+)+Pb^(2+)复合条件下,TNF-α的表达显著上调。在Cu^(2+)、Pb^(2+)条件下,Hsp90、Hsp70、iNOS和COX-2的表达量均下调。结果表明,各浓度Cu^(2+)、Pb^(2+)与Cu^(2+)+Pb^(2+)对青海湖裸鲤均产生毒性影响,各基因均对低浓度重金属离子作用产生应答。

青海湖裸鲤肾细胞的原代培养和传代培养

采用组织块移植培养技术,用RPMI 1640培养基对来源于青海湖裸鲤（Gymnocypris przewalskii）肾组织的细胞进行原代培养。结果显示：培养48 h可见组织块周围有细胞迁出,并形成生长晕;培养一周可形成单层细胞;对原代培养的单层细胞用胰蛋白酶-EDTA消化后,传代培养至第四代。实验初步确立青海湖裸鲤肾细胞培养条件为：培养基RPMI 1640,培养温度为27℃,pH值为7.0~7.5,原代培养血清浓度为20%,传代培养的血清浓度为10%,无需通入CO2。

不同溶解氧水平对青海湖裸鲤肝组织结构及抗氧化酶活性的影响

为研究不同溶解氧水平对青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)肝组织结构、线粒体超微结构及抗氧化酶活性的影响,选取120尾平均体重为(97.68±0.12)g的青海湖裸鲤,随机分为三组:中度低氧组(3.0±0.1)mg/L、重度低氧组(0.7±0.1)mg/L和常氧组(8.4±0.1)mg/L,于低氧胁迫8 h和24 h,观察肝组织结构并检测线粒体膜电位及抗氧化酶活性。结果显示:中度和重度低氧胁迫使青海湖裸鲤肝血窦扩张,血窦内红细胞数量增多,中度低氧对肝组织显微和线粒体超微结构未造成损伤,线粒体排列整齐,形态正常,但重度低氧使肝细胞出现空泡化,且随低氧胁迫时间延长肝细胞空泡变性更严重,重度低氧24 h时线粒体数量减少,部分线粒体出现空泡化。肝组织线粒体膜电位在中度低氧胁迫后显著升高,重度低氧胁迫后显著降低。中度和重度低氧胁迫使肝组织过氧化氢(H 2O 2)含量、总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性显著升高,但对超氧化物歧化酶(SOD)活性无影响;中度低氧对丙二醛(MDA)含量无影响,但重度低氧使MDA含量显著增加。结果表明,低氧胁迫对青海湖裸鲤肝组织造成氧化应激,但中度低氧对肝组织结构和线粒体未造成损伤,重度低氧导致肝组织结构及线粒体损伤,且低氧胁迫后肝组织通过调整相关抗氧化酶活性提高其低氧适应能力。

青海湖裸鲤人工繁殖技术

总结了淡水培育的青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)的人工繁殖技术,包括亲鱼培育、人工繁育等。2015—2018年繁育试验中,亲鱼平均相对怀卵量为46.20粒/g体重,催产率可达80.00%,受精率89.52%,孵化率95.46%。

祁连山裸鲤和青海湖裸鲤mtDNA cyt b基因和D-loop区序列特征及遗传分化

对65尾祁连山裸鲤(Gymnocypris chilianensis)和40尾青海湖裸鲤(G.przewalskii)mt DNA cyt b基因(Cytochrome b,cyt b 1140 bp)和D-loop区(747 bp)基因片段进行了扩增和测定,探讨了上述基因片断的序列特征和两种裸鲤的遗传分化关系。结果显示,2个基因片段的G含量普遍较低,在编码基因cyt b各密码子的第三位上表现得尤为突出。线粒体DNA cyt b和D-loop基因片段均存在明显的遗传分化,核苷酸替代速率cyt b>Dloop。基于核苷酸最佳替换模型计算2种间的遗传距离,cyt b为0.08,D-loop为0.03。基于cyt b基因序列分析结果表明,两物种发生遗传分化的时间在距今约220万年的更新世初期,与青藏高原隆升时期相吻合。

不同温度下青海湖裸鲤的耗氧率、耗氧量与呼吸频率的关系

研究了不同温度（5±0．5）℃、（10±0．5）℃、（15±0．5）℃、（20±0．5）℃和（25±0．5）℃）下青海湖裸鲤（Gymnocypris przewalskii）的耗氧率、耗氧量与呼吸频率的关系。结果表明，耗氧率、耗氧量和呼吸频率均随着温度的升高而升高，且不同温度间差异显著（P＜0．01）。呼吸频率在5～10℃较低温度时没有明显差异（P＞0．05）。呼吸频率在不同的温度下都存在明显的昼夜差异（P＜0．05），白天明显高于夜晚。不同温度下呼吸频率和耗氧率的回归关系为y＝63．052 e（0．0115x）（R2＝0．9822）；呼吸频率和耗氧量的回归关系为y＝－1．7197 x2＋38．437 x －61．914（R2＝0．9618）。在15～20℃间的耗氧率、耗氧量和呼吸频率相对变化较小，为适宜养殖的水温。

3种麻醉剂对虹鳟、细鳞鲑、青海湖裸鲤麻醉效果的比较

虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、细鳞鲑(Brachymystax lenok)、青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)在人工繁殖、标志放流、科学实验等操作中需要使用麻醉剂。为找到麻醉的最佳药物及安全有效剂量,试验采用三氯叔丁醇、苯氧乙醇、丁香油3种麻醉剂不同的剂量分别对虹鳟、细鳞鲑、青海湖裸鲤三种鱼进行麻醉。试验结果表明:三氯叔丁醇入麻和恢复所需时间都较长,苯氧乙醇入麻和恢复时间都较短,丁香油入麻时间短但恢复时间长。对虹鳟、细鳞鲑、青海湖裸鲤来说,相对于三氯叔丁醇和丁香油,苯氧乙醇是较安全有效的麻醉剂,适合的剂量为0.2‰。

青海湖裸鲤和花斑裸鲤消化酶活力对比

本实验对比研究青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)和花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)消化酶活性差异。两种鱼各挑选9尾体重100g左右的鱼作为实验对象,分别检测肝胰脏、前肠、中肠及后肠中的脂肪酶、淀粉酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶活性。结果表明:作为无胃鱼,两种鱼肠道消化酶活性显著高于肝胰脏,其中前肠是主要的消化器官,后肠具有较高的蛋白质消化能力。通过对比研究发现青海湖裸鲤具有较高的脂肪和糖类消化能力,而花斑裸鲤具有较高的蛋白质消化能力。

体重对青海湖裸鲤排氨率和排氨量的影响

为了解体重对青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)排氨率和排氨量的影响,在21℃左右的水温下,结合对青海湖裸鲤耗氧率和呼吸频率的测定,采用酚盐分光光度法测定并研究了不同体重下青海湖裸鲤的排氨量、排氨率。结果表明:不同体重的青海湖裸鲤在基础呼吸代谢过程中其排氨量方面有极显著的差异(P<0.01)。青海湖裸鲤的排氨量随着体重的增加而增加,呈幂指数关系。不同体重的青海湖裸鲤的排氨率等也有显著差异(P<0.01),随着体重的增加排氨率相对降低。

青海湖裸鲤特征挥发性成分分析

为分析青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)特征挥发性成分,以体重为20g的青海湖裸鲤作为研究对象,剖取肌肉后采用固相微萃取(SPME)结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)对裸鲤肌肉挥发性成分进行分离鉴定。结果表明,在青海湖裸鲤肌肉中检测出60种化合物,包括8种醇类化合物、9种醛类化合物、5种酮类化合物、2种酸类化合物、8种酯类化合物、12种烃类化合物、12种芳香族化合物及4种其他类物质,其中芳香族化合物含量最高。结合气味活度值(OVA)分析,青海湖裸鲤肌肉挥发性气味的主要贡献化合物为1-辛烯-3-醇、己醛、辛醛、壬醛、2-癸烯醛及2,4-癸二烯醛。

青海湖裸鲤IL-8的原核表达及诱导条件优化

白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)是一种CXC家族趋化因子,主要通过趋化炎症细胞参与机体免疫反应。本研究通过RT-PCR技术,扩增得到含一对酶切位点的青海湖裸鲤IL-8成熟蛋白DNA序列(gpIL-8),经酶切连接至pET30a(+)质粒得到原核表达重组质粒pET30a-gpIL-8,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21后成功诱导得到分子量约13.7 kD的重组蛋白,重组蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。通过对影响蛋白表达量的诱导物浓度和诱导时间进行优化,发现包涵体重组蛋白表达量随诱导时间增加而增加,随诱导物浓度增加呈先增加后减少的趋势,在0.4 mmol/L IPTG诱导8 h时表达量最高。可溶性重组蛋白表达量总体上随诱导时间的增加呈先增加后减少趋势,随诱导物浓度的增加表达量无明显改变,在0.4 mmol/L IPTG诱导6 h时即可表达高浓度的可溶性重组蛋白。因可溶性蛋白有利于后续实验,故利用最佳诱导条件诱导后对可溶性蛋白进行纯化,得到高纯度的IL-8重组蛋白,测得浓度达101.5μg/mL,满足后续实验要求。本研究为青海湖裸鲤IL-8多克隆抗体制备,及其功能、作用机制研究提供了理论依据。

线粒体控制区在鱼类种内遗传分化中的意义

线粒体DNA(mtDNA)作为分子标记已被广泛应用于各物种系统发生的研究。mtDNA控制区序列(D-loop)以其较高的突变积累对于研究物种种内的遗传分化具有重要价值。鱼类是脊椎动物中最原始但在种属数量上又最占优势的类群,其物种繁多,分布广泛,起源复杂,研究其系统发生历来是令人饶有兴趣的课题。D-loop在研究鱼类种内遗传分化中具有多方面的重要意义。近年来,已有越来越多的研究工作将D-loop作为分子标记来探讨各种鱼类的种内遗传分化,并且获得了许多有启发性的结果。青海湖是我国内陆最大的咸水湖,湖中主要鱼类为青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii),D-loop分析初步结果显示青海湖及其周围河流中的裸鲤似乎没有新的种内遗传分化现象。