青霉素结合蛋白与金黄色葡萄球菌耐药性关系研究

金黄色葡萄球菌(SA)是造成医院内感染和社区感染的常见病原菌之一。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)等多重耐药菌出现,在医学界引起了广泛关注。青霉素结合蛋白(PBPs)的改变与MRSA和VRSA的耐药机制有密切关系。研究青霉素结合蛋白与MRSA和VRSA耐药性之间关系有重要意义。

肺炎链球菌青霉素MIC与PBP变异的关系

目的探讨肺炎链球菌(Sp)青霉素抗生素最小抑菌质量浓度(MIC)与青霉素结合蛋白(PBP)1A、2B和2X变异的关系。方法用MIC法对51株Sp进行青霉素药敏试验,并提取每株Sp的DNA,分别对其PBP1A、PBP2B中编码青霉素结合区域进行PCR扩增然后测序,并用软件进行序列比对,分析PBP1A、2B保守序列的氨基酸置换。结果在所有MIC≤1 mg/L的青霉素敏感Sp(PSSP)中均未发现PBP1A突变,而在MIC>1 mg/L时多数菌株出现Thr574-(Asn)、Ser575-Thr、Gln576-Gly(、Phe)577-(Tyr)4个连续残基的置换变异和Thr371-Ser的置换。PBP2B在所有MIC≤1 mg/L的PSSP中均未发生任何突变;而当MIC分别大于1 mg/L和2 mg/L时,均出现445Thr-Ala和Glu338-Gly。结论 PBP1A、PBP2B基因突变分别可导致其表达的PBP1A、PBP2B结构异常,与青霉素(包括其他β内酰胺类抗生素)亲和力下降,继而青霉素耐药。

肺炎链球菌青霉素结合蛋白2B、1A、2X氨基酸置换对β内酰胺类抗生素最小抑菌浓度的影响

目的分析肺炎链球菌（SP）青霉素结合蛋白（PBP）2B、1A、2X保守序列氨基酸置换对其β内酰胺类抗生素抗菌活性的影响。方法用E—test法测定59株SP对6种β内酰胺类抗生索最小抑菌浓度（MIC），并对其青霉素结合蛋白基因（pbp）2b、1a、2x的编码片段进行套式PCR扩增和基因测序，根据氨基酸置换类型进行分型。PBP2B分为：PBP2BI型（无变异）；PBP2BⅡ型[谷氨酰胺432→亮氨酸和（或）苏氨酸445／451→丙氨酸／丝氨酸、谷氨酸481→甘氨酸，其中1株存在431／432脯氨酸的插入]；PBP2BⅢ型（兼具PBP2BⅡ型变异及丙氨酸624→甘氨酸）。PBP1A编码基因变异分为：PBP1AⅠ型（无变异）；PBP1AⅡ型（苏氨酸574→天冬氨酸，丝氨酸575→苏氨酸，谷氨酰胺576→甘氨酸，苯丙氨酸577→酪氨酸，即574TSQF→NTGY）；PBP1AⅢ型（574TSQF→NTGY及苏氨酸371→丙氨酸／丝氨酸、脯氨酸432→苏氨酸）。PBP2X编码基因变异分为：PBP2XⅠ型（无变异）；PBP2XⅡ型（组氨酸394→亮氨酸或苏氨酸338→丙氨酸）；PBP2XⅢ型（苏氨酸338→丙氨酸，异亮氨酸371→苏氨酸、精氨酸384→甘氨酸和亮氨酸546→缬氨酸）；PBP2X1V型（兼具PBP2XⅢ型变异及蛋氨酸339→苯丙氨酸，蛋氨酸400→苏氨酸）。分析各型氨基酸置换与抗生素MIC的关系。结果59株SP对6种β内酰胺类抗生素的药敏分布（敏感株、中介株、耐药株）分别为青霉素（12、29、18）；阿莫西林（49、9、1）；头孢呋辛（16、16、27）；头孢曲松（47、1、11）；头孢噻肟（47、3、9）；亚胺培南（49、10、0）。PBP2BⅢ型、PBP1AⅢ型及PBP2XⅢ、PBP2X1V型SP对β内酰胺类抗生素的不敏感株（中介株＋耐药株）明显增多，SP的β内酰胺类抗生素MIC。明显升高。结论PBP2B、1A、2X保守序列中或附近的氨基酸置换可明显升高SP的β内酰胺类抗生素MIC值。

肺炎链球菌青霉素结合蛋白基因多态性与其青霉素敏感性的关系

目的探讨肺炎链球菌青霉素结合蛋白基因(pbps)多态性与青霉素敏感性的关系。方法以包括63株青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSP)和69株青霉素敏感菌(PSSP)共132株菌为研究对象,浓度梯度(E-test)法检测青霉素最低抑菌浓度(MIC),PCR法扩增pbp2b、pbp2x和pbp1a,分析其限制性片段长度多态性(RFLP)。结果pbp1a有9种型,其中两种见于PSSP和部分PNSP菌株,其他7种主要见于青霉素MIC值≥0·25μg/ml的菌株(21/22)。pbp2b有10种型,其中3种型见于PSSP和部分PNSP菌株,其他7种主要见于青霉素MIC≥0·25μg/ml的菌株(20/22)。pbp2x谱型31个,PSSP菌株中有17种,其中13种仅见于PSSP菌株;余下14种只存在于PNSP(35株)。pbp1a、pbp2b和pbp2x组合的pbps型共47种,PSSP菌株中23种,其中17种仅存在于PSSP;其他24种仅见于PNSP(36株)。根据pbp1a或pbp2b基因型判断青霉素敏感,虽然敏感度高,但特异度较低(<50%),准确性也较低;根据pbp2x或pbps基因型判断,敏感度、特异度和准确性均在85%以上。结论肺炎链球菌青霉素耐药主要与PBP1a、PBP2b和PBP2x变异有关;根据肺炎链球菌pbps基因多态性,可快速准确地判断其青霉素敏感性。

头孢曲松低敏的淋球菌中青霉素结合蛋白2氨基酸替代或插入模式研究

目的检测头孢曲松低敏的淋球菌中青霉素结合蛋白2（PBP2）模式，探讨其是否与淋球菌对头孢曲松敏感性降低有关。方法将11株头孢曲松低敏和2株头孢曲松敏感的淋球菌penA基因全基因测序，通过BLASTn与BLASTx分析，研究penA基因的碱基插入和置换情况及PBP2中氨基酸插入和置换模式。结果13株淋球菌的penA基因中有多个碱基置换或插入，PBP2中共发现5种模式的氨基酸插入或置换模式，没有发现PBP2镶嵌状结构模式。结论PBP2的镶嵌状结构可能不是导致淋球菌对头孢曲松敏感性下降的主要因素。

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌临床分离株青霉素结合蛋白2a的克隆表达及鉴定

目的 应用基因重组技术对编码甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离株青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的mecA基因片段进行克隆、表达。方法 从临床样本巾分离鉴定出MRSA，根据基因文库收录的mecA基因编码序列，针对编码PBP2a第25～668位氨基酸的mecA基因片段设计引物，扩增目的基因片段，克隆至pQE30载体，经酶切鉴定、测序后，再转化E．coliM15（pREP4）。采用1mmol／L的异丙硫半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达及鉴定。结果重组表达质粒pQE30-mecA构建成功，基因测序结果显示，扩增的mecA基因DNA片段全长为1932bp，其巾有9个碱基突变。IPTG诱导后6h，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，M15（pQE30-mecA）出现一条相对分子质量约74×10^3的蛋白条带，且一部分以可溶性形式存在；M15（pQE30）未出现特异性蛋白条带。经诱导表达和鉴定证实，表达出的可溶性目的蛋白为PBP2a。结论 利用本技术可成功表达MRSA临床分离株中的可溶性PBP2a。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白的低温诱导表达纯化及免疫原性的鉴定

目的探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）PBP2a的原核表达及其免疫源性的鉴定。方法根据基因文库登录的mecA基因的编码序列，设计合成了一对寡核苷酸引物，将mecA基因的70～2006bp克隆至pET28a载体，转化E．coliBL21（DE3）；经IPTG低温诱导表达后，利用镍琼脂糖凝胶亲和层析技术纯化目的蛋白；用抗PBP2a抗体鉴定纯化蛋白的免疫源性。结果成功构建了不合跨膜区的PBP2a原核表达载体，在低温诱导条件下获取的蛋白纯化后无杂蛋白；该蛋白能与商品化抗PBP2a单克隆抗体结合。结论利用分子克隆技术，获得了高纯度的不合跨膜区的PBP2a蛋白，且该蛋白具有免疫源性，为进一步制备抗PBP2a单克隆抗体奠定了基础。

青霉素不敏感的肺炎链球菌pbp2b基因新的变异

目的调查本地区青霉素不敏感肺炎链球菌（PNSP）的pbp2b基因和氨基酸序列的变异特点。方法2006年1—12月收集肺炎链球菌临床分离株24株，检测其对青霉素的敏感性，对青霉素不敏感肺炎链球菌的青霉素结合蛋白pbp2b基因进行PCR扩增和测序以及序列比对与生物信息学分析。结果在13株青霉素不敏感肺炎链球菌[最低抑菌浓度（MIC）≥0．1mg／L]中，均发生紧邻SSN的Thr445→Ala替换以及Glu475→Gly、Thr488→Ala／Ser的替换；而Glu332→Gly的替换也较常见，存在于12株PNSP（MIC≥0．25mg／L）；另外，在7株青霉素耐药的肺炎链球菌（MIC≥3mg／L）中，均发生了紧邻KTG之后Ala618→Gly的替换，且这7株菌属于Baek’sⅡ群，与韩国菌株J77的核苷酸及氨基酸序列一致，而菌株14，15，8，11及24的氨基酸序列出现了新的变异，已向GenBank提交序列，获得序列号：EU035970，EU056919，EU056920，EU056921，EU106886。结论本地区大多数的青霉素耐药肺炎链球菌pbp2b基因的变异序列高度相似，而青霉素中度敏感肺炎链球菌的基因序列产生新的变异。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a的原核表达及多克隆抗体的制备

目的研究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的原核表达,及PBP2a多克隆抗体的制备。方法根据基因文库登录的mecA基因的编码序列,设计合成了1对寡核苷酸引物,应用PCR法从MRSA基因组中获得编码PBP2a全长的DNA,将此目的基因片段克隆至pET32a(+)载体,转化E.coliBL21(DE3);经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,利用Ni2+亲和层析技术纯化目的蛋白;用目的蛋白免疫小鼠3～8次后,收获血清并鉴定。结果成功构建了PBP2a原核表达载体,并获得了高效表达;利用纯化的蛋白制备了理想的多克隆抗体。结论利用分子克隆技术,获得了高纯度的PBP2a蛋白并制备了多克隆抗体,为其进一步研究奠定了基础。

侵袭性肺炎链球菌β内酰胺类抗菌药物耐药机制研究

目的：了解上海市儿童医院临床分离侵袭性肺炎链球菌的耐药状况、对β内酰胺类抗菌药物的耐药机制，为抗菌药物的合理应用提供参考依据。方法本研究为针对抗菌药物耐药机制的基础性研究。收集上海市儿童医院2005年1月至2011年12月临床分离的侵袭性肺炎链球菌62株，采用E-test法测定分离株对9种抗菌药物的MIC。 PCR扩增肺炎链球菌的青霉素结合蛋白编码基因pbp2x、pbp2b、pbp1a，分析突变与β内酰胺类抗菌药物耐药水平的相关性。 PCR扩增肺炎链球菌的murM基因，分析其突变与β内酰胺类抗菌药物耐药水平的相关性。结果在62株侵袭性肺炎链球菌中，青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）的检出率为43．6％（27/62）。 pbp2b基因保守序列附近的基因突变率，青霉素中介肺炎链球菌（PISP）（100％，25/25）与青霉素敏感肺炎链球菌（PSSP）（3/10）、PSSP（3/10）与PRSP（100％，27/27）之间的差异有统计学意义（χ2分别为21．875和23．310，P均＜0．01）。 pbp2x基因保守序列附近及内部的基因突变率，PISP（84％，21/25）与PSSP（0）、PSSP（0）与PRSP（85．2％，23/27）之间的差异有统计学意义（χ2分别为21．000和22．513，P 均＜0．01）。pbp1a基因保守序列附近及插入序列的基因突变率，PISP（68％，17/25）与PSSP（0）、PRSP（100％，27/27）与PSSP（0）、PRSP（100％，27/27）与PISP（68％，17/25）之间的差异均有统计学意义（χ2分别为13．22、37．000、10．211，P均＜0．01）。 murM基因的碱基突变率，青霉素MIC≥8 mg/L或头孢曲松MIC≥2 mg/L组（95．8％，23/24）和青霉素MIC＜8 mg/L或头孢曲松MIC＜2 mg/L组（0）差异有统计学意义（χ2＝56．2，P＝0．0026）。结论上海市儿童医院分离的侵袭性肺炎链球菌耐药现象严重。pbps基因和murM基因突变在β内酰胺类抗菌药物耐药中均发挥作用，且与抗菌药物耐药水平有一定的相关性。

小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用

目的 研究小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶（NagZ）的调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用.方法 通过对小肠结肠炎耶尔森菌3个AmpD蛋白同系物（AmpD1～3）基因（ampD1～3）、低分子量青霉素结合蛋白（LMM PBPs）基因（pbp4、pbp5a、pbp5b、pbp7）、NagZ基因（nagZ）以及ampR基因进行敲除或回补,以构建基因突变株,并利用头孢西丁对突变株进行诱导;采用检测头孢硝噻吩水解法测定诱导组和非诱导组突变株AmpCβ-内酰胺酶活性（单位为U）,采用luxCDABEreporter系统检测AmpCβ-内酰胺酶启动子活性[单位为相对光单位（RLU）],采用对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷为显色底物测定NagZ酶活性（单位nmol/L）.结果 AmpD1蛋白的功能较强,YEΔD1突变株的AmpCβ-内酰胺酶表达量出现上升,诱导组和非诱导组分别为（3.29±1.58）和（4.08±1.75）U.YEΔ5b、YEΔ4Δ5b、YEΔ5aΔ5b和YEΔ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性增强,其中YEΔ4Δ5b突变株活性最高,诱导组和非诱导组分别为（106903.16±61910.61）和（205427.45±45352.17）RLU.缺失3种基因的菌株中,YEΔ4Δ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为（304108.04±99274.53）和（531440.21±68891.02）RLU;缺失4种基因的菌株中,YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为（1013810.99±260955.96）和（1230214.59±205526.79）RLU;敲除nagZ基因后,YEΔD1D2D3ΔZ突变株AmpCβ-内酰胺酶活性未发生明显的变化,而YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔZ突变株活性下降明显,诱导组和非诱导组分别为（0.30±0.20）和（0.29±0.21）U,基本降至野生株水平.结论 在肠杆菌科细菌中发现多个AmpD蛋白参与ampC基因的三级调控机制;发现以PBP5b为主,PBP4、PBP5a和PBP7共同参与的ampC基因调控模式;同时还证实了在小肠结肠炎耶尔森菌具有NagZ依赖和非依赖两种ampC基因调控途径.

磷霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a亲和力的研究

目的 研究磷霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的亲和力.方法 临床标本分离鉴定的MRSA菌株,经增菌培养后分为标准菌株对照组、MRSA组、磷霉素组、头孢唑林组及磷霉素、头孢唑林联合组,并与ATCC25923标准菌株对照,进行蛋白电泳,观察青霉素结合蛋白的表达.结果 磷霉素与头孢唑林联合后MRSA菌株的PBP2a条带变弱至消失.结论 磷霉素与头孢唑林联用对MRSA的PBP2a有高度亲和力.