耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a转肽酶区的克隆、表达及纯化鉴定

目的构建编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)转肽酶区基因片段的原核表达载体,并表达、纯化及鉴定蛋白。方法从临床标本中分离鉴定MRSA,设计针对编码PBP2a转肽酶区基因片段的引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,克隆至pET28a(+)载体,双酶切鉴定并测序,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS株;用0.7mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,利用Ni亲和层析技术纯化目的蛋白;蛋白免疫印迹法(WB)鉴定重组蛋白。结果重组表达载体经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切,产物在预期大小处出现条带,测序结果显示有两个碱基突变,无移码突变。所表达的PBP2a蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和WB鉴定,在相对分子质量38×103处可见一新生蛋白条带。结论成功构建了PBP2a转肽酶区原核表达载体,并获得了高效表达,制备了高纯度的目的蛋白。

青霉素结合蛋白2a C-末端在大肠杆菌M15中的表达、纯化及鉴定

目的构建含目的基因mecA C末端的重组子并在大肠杆菌M15中进行蛋白表达。方法采用PCR方法扩增mecA C末端DNA,将其与表达载体pQE30连接;再通过PCR及双酶切鉴定连接产物。将含目的基因片段的阳性重组质粒转化大肠杆菌M15后,用1mmol／L的IPTG进行诱导表达。应用Ni-NTA琼脂糖进行亲和层析纯化目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定。结果成功构建pQE30-mecA重组表达质粒,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,亲和层析纯化获得分子量为39．7kDa的蛋白;Western blotting和肽指纹图谱证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白。结论在大肠杆菌内成功表达具有活性的PBP2a,为后期研究和开发抗MRSA药物奠定了基础。

青霉素结合蛋白2a单克隆抗体的研制和初步应用

目的 研制青霉素结合蛋白2a（PBP2a）单克隆抗体（McAb）,为建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）免疫层析检测方法提供检测用抗体.方法 以基因工程抗原rPBP2a免疫BALb/c小鼠,通过常规小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用免疫印迹技术（Western blotting）分析单克隆抗体特异性.选取敏感、特异的单克隆抗体进行金标记和硝酸纤维膜包被,建立胶体金免疫层析检测方法.结果 共获得11株分泌抗rPBP2a的杂交瘤细胞,其中6株分泌的单克隆抗体能够与天然PBP2a呈阳性反应.用其中2株单克隆抗体建立的PBP2a胶体金免疫层析方法,可在5～ 20 min内完成检测.结论 获得了特异性针对PBP2a蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测PBP2a蛋白的胶体金免疫层析检测方法,为临床快速、简便检测产生PBP2a的细菌提供了检测方法.

青霉素结合蛋白2a乳胶凝集法快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的评价青霉素结合蛋白2a（PBP-2a）乳胶凝集法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRsA）的实验方法。方法用苯唑西林盐琼脂筛选平皿法和PBP-2a乳胶凝集法对68株金黄色葡萄球菌临床分离株进行MRsA检测。结果用苯唑西林盐琼脂筛选平皿法检出MRsA50株、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）18株，用PBP-2a乳胶凝集法检测的结果与前法完全相同。2种方法的符合率为100％。结论PBP-2a乳胶凝集法是一种快速、简便、准确检测MRSA的方法。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的苯唑西林、头孢西丁最低抑菌浓度与青霉素结合蛋白2a的相关性

为分析金黄色葡萄球菌(S·aureus,SA)的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的产生与头孢西丁、苯唑西林最低抑菌浓度(MIC)相关性,收集102株临床分离株,采用MIC法分别检测SA对头孢西丁、苯唑西林的耐药性,并与耐甲氧西林SA(MRSA)胶乳凝集法对比分析。结果表明,头孢西丁MIC≥32μg/ml71例(69·6%),其中乳胶凝集试验阳性70例(98·6%);苯唑西林MIC≥4μg/ml80例(78·4%),乳胶凝集试验阳性70例(87·5%)。头孢西丁阳性的PBP2a检出率明显高于苯唑西林(98·6%比87·5%,P<0·05)。结论:头孢西丁MIC≥32μg/ml或产生PBP2a的SA均能正确地表达为MRSA;苯唑西林MIC≥4μg/ml解释标准对SA评价MRSA正确性较低。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a转肽酶区的原核表达及其纯化

目的原核表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a,PBP2a)转肽酶区,并进行纯化及鉴定。方法 PCR扩增编码PBP2a转肽酶区的mec Af基因片段,克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组表达质粒p GEX-6p-mec Af,经双酶切(Bam HⅠ和Eco RⅠ)及测序鉴定正确后,转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21进行诱导表达;经蛋白亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果重组表达质粒p GEX-6p-mec Af经双酶切(Bam HⅠ和Eco RⅠ)及测序鉴定证明构建正确;表达产物的相对分子质量约63 000,表达量约占菌体总蛋白的14.5%,纯化后纯度达90%。结论成功构建了PBP2a转肽酶区的原核表达质粒,目的蛋白在E.coli中获得高效表达,为制备单克隆抗体及建立MRSA快速检测方法奠定了基础。

凝固酶阴性葡萄球菌的青霉素结合蛋白产生和苯唑西林MIC相关性研究

目的分析凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的产生和苯唑西林MIC相关性。方法收集82株临床分离株,采用MRSA胶乳凝集法、MIC法分别检测CNS对苯唑西林的耐药性,比较各试验结果。结果苯唑西林MIC≥0.5mg/L或产生PBP2a的表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌均能正确地表示苯唑西林耐药;苯唑西林MIC≥0.5mg/L解释标准对头葡萄球菌、腐生葡萄球菌、人葡萄球菌、模仿葡萄球菌等CNS评价苯唑西林为耐药,正确性很低,有80.0%未产生PBP2a的菌苯唑西林MIC≥0.5mg/L,使这些菌被错误地报道苯唑西林耐药。结论新的苯唑西林解释标准对产生PBP2a的CNS均能正确地评价,而对未产生PBP2a的CNS某些菌种缺乏特异性;MRSA胶乳凝集试剂盒可快速、准确地检测耐苯唑西林的CNS。

抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的： 制备和鉴定抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体（mAb）, 初步建立检测PBP2a的乳胶凝集方法.方法： 以基因工程重组PBP2a转肽酶区蛋白为抗原, 免疫BALB/c小鼠, 制备鼠源性mAb, 间接ELISA鉴定IgG亚类、腹水效价及亲和常数, Western blot检测mAb的特异性, 用所得mAb致敏聚苯乙烯乳胶, 建立检测PBP2a的乳胶凝集方法.结果： 筛选出2 株能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株F1和F2, 免疫球蛋白亚类均为IgG1类; 腹水效价为0.5×10^6 ～1×10^6, 亲和力常数分别为1.57×10^8 M^-1和5.43×10^9 M^-1.Western blot显示F1、F2抗体均能有效识别重组PBP2a转肽酶区蛋白及MRSA临床分离株中的天然PBP2a, 用 mAb F2建立了乳胶凝集法, 敏感性达1 mg/L.结论： 获得2株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株, 为研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础.

重组PBP2a转肽酶区蛋白核酸适配体的筛选及鉴定

目的筛选和鉴定重组青霉素结合蛋白2a(PBP2a)转肽酶区蛋白的核酸适配体。方法利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX),以重组PBP2a转肽酶区蛋白为靶标,从单链DNA文库中筛选能与之特异性结合的核酸适配体。筛选产物克隆测序后,对其进行结构分析和特性鉴定。结果经过11轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第8、10轮筛选产物克隆测序,对获得的40个适配体进行分析,一级结构分析显示40个适配体并无共同的保守序列,二级结构预测分析表明,其可分为3个家族。其中13号适配体与重组PBP2a蛋白亲和力最高,并能与之特异性结合。结论利用SELEX技术成功筛选出特异性结合重组PBP2a转肽酶区蛋白的核酸适配体,为探索耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的诊疗新途径奠定基础。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽酶区的克隆表达及纯化鉴定

目的:对编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)转肽酶区的mecA基因片段进行克隆、表达、纯化及鉴定。方法:根据基因文库登录的mecA基因的编码序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,应用PCR技术从MRSA基因组DNA中扩增获得编码PBP2a转肽酶区的DNA片段,将此目的基因片段克隆至pET-His载体,经酶切鉴定、测序正确后,转化E.coliBL21(DE3)plysS;用IPTG进行诱导表达后,利用Ni2+亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白;对表达的蛋白以MRSA胶乳凝集试剂盒进行鉴定。结果:成功构建了PBP2a转肽酶区原核表达载体,并获得了高效表达,制备了高纯度的目的蛋白。结论:获得了高纯度的PBP2a转肽酶区蛋白,为其进一步研究奠定了基础。

PBP2a多克隆抗体制备及其乳胶凝集检测法的建立

目的制备兔抗青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a,PBP2a)抗体,建立检测PBP2a的乳胶凝集法。方法以重组PBP2a转肽酶区蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blot法检测所制备的抗血清效价和特异性,用纯化的多抗建立乳胶凝集法。结果纯化的重组蛋白免疫家兔能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达1∶25 600,Western blot显示该抗体能有效识别原核表达及MRSA临床分离株中的PBP2a,建立了乳胶凝集法,敏感性及特异性良好。结论成功制备了抗PBP2a抗体血清,初步建立了检测PBP2a的乳胶凝集法,为有效制备高特异的单克隆抗体进而研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础。

抗MRSA-PBP2a鸡卵黄抗体的制备及乳胶凝集检测法的建立

制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a(MRSA-PBP2a)抗原的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),建立检测MRSA的乳胶凝集方法。采用体外诱导的方法制备PBP2a蛋白,胸部肌肉多点注射方式免疫6只海蓝蛋鸡,水稀释法提取IgY,BCA法测定蛋白含量,Western blotting进行特异性分析,用提取的IgY抗体致敏聚苯乙烯乳胶,建立检测PBP2a的乳胶凝集方法。成功诱导并制备获得纯化的PBP2a蛋白,首次免疫后1月每枚鸡蛋提纯后可获得约48 mg IgY抗体,Western blotting结果显示IgY抗体能有效识别纯化的PBP2a蛋白;成功建立检测PBP2a的乳胶凝集法,敏感性达1 mg/L。抗MRSA-PBP2a鸡卵黄抗体具有较高的敏感性和特异性,基于其建立的乳胶凝集检测方法具有较好的灵敏性。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a的真核表达及其在抗体鉴定中的应用

目的利用杆状病毒表达系统表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a（PBP2a）。方法用EcoRI和BamHI双酶切pGEMT-meeA重组质粒DNA，回收目的基因mecA，与pFastBacl质粒连接转化入含有穿梭载体bacmid的大肠埃希菌DHl0Bac中，筛选重组穿梭载体Bacmid-mecA并转染Sf9细胞，获取完整的重组杆状病毒。用免疫荧光（IFA），Westernblot法进行蛋白鉴定。结果成功地获得含mecA基因的重组杆状病毒。杆状病毒感染Sf9细胞形态变化明显，能够表达出与PBP2a多克隆抗体相结合的蛋白。结论利用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统成功地表达了PBP2a蛋白。

MRSA表面标志物PBP2a的检出与苯唑西林MIC的相关性分析

目的研究MRSA表面标志物PBP2a与苯唑西林MIC的相关性。方法收集62株金黄色葡萄球菌临床分离株,通过乳胶凝集试验和全自动细菌分析仪分别检测青霉素结合蛋白2a(PBP2a)和苯唑西林MIC值。结果62株金葡中32株PBP2a检测阳性,30株PBP2a检测阴性。苯唑西林MIC≥4μg/ml31株,苯唑西林MIC≤2μg/ml31株。在苯唑西林MIC≥4μg/ml的31株MRSA中30株PBP2a检测均为阳性。结论金黄色葡萄球菌耐苯唑西林的耐药水平与PBA2a的检出有较好的相关性。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌异质性耐药株检测方法探讨

目的探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的异质性耐药株的检测方法。方法收集102株金黄色葡萄球菌,采用微量肉汤稀释法分别检测其对头孢西丁、苯唑西林的耐药性,乳胶凝集法检测青霉素结合蛋白2a(PBP2a),同时采用菌群谱分析法对异质性耐药株进行筛选。结果头孢西丁耐药71例(69.6%),其中PBP2a阳性70例(98.6%);苯唑西林耐药80例(78.4%),其中PBP2a阳性70例(87.5%)。头孢西丁耐药菌株PBP2a检出率明显高于苯唑西林(P<0.05)。苯唑西林耐药而头孢西丁敏感的9株菌中筛选出2株(22.2%)异质性耐药株。结论头孢西丁检出MRSA的敏感性优于苯唑西林,但苯唑西林对MRSA异质性耐药菌株检测的敏感性优于头孢西丁。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因原核表达载体的构建

目的对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)mecA基因片段进行扩增表达,纯化及鉴定。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增技术获得编码PBP2a转肽酶区的mecA基因片段,将此目的基因片段与pET-21a(+)载体连接,构建pET-21a(+)-mecA的重组质粒,经双酶切、测序正确后,将重组质粒转入E.coli BL21 DE3中,用IPTG诱导mecA融合蛋白,并对表达产物进行鉴定。结果构建了mecA基因的原核表达载体,并获得高效表达。结论获得了mecA基因编码的PBP2a蛋白,为MRSA的耐药机制、药物治疗等进一步研究奠定了基础。

乳胶凝集法快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法评价

目的 评价PBP-2a乳胶凝集法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的试验方法。方法 应用美国临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的苯唑西林盐琼脂筛选平皿法和PBP-2a乳胶凝集法对临床分离的30株金黄色葡萄球菌进行MRSA的检测。结果 用苯唑西林盐琼脂筛选平皿法检出MRSA 24株,甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)6株,用PBP-2a乳胶凝集法检测的结果与前法完全相同。两种方法的符合率为100% 。结论 PBP-2a乳胶凝集法是一种快速、简便、准确检测MRSA的方法。

单克隆抗体标志乳胶凝集试验快速检测金黄色葡萄球菌及其耐药性

目的探讨金黄色葡萄球菌(SAU)的细菌学快速检测鉴定及其耐药性分析的试验方法。方法目标菌落先经传统鉴别方法怀疑葡萄球菌,采用Slidex MRSA Detection乳胶快速检测SAU菌株青霉素结合蛋白2a(PBP2a),确认耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA);设立SAU耐苯唑西林筛选试验对照,两组不符合菌株经PCR方法检测MceA基因确认。结果456株葡萄球菌中Slidex(staph.plus乳胶凝集法阳性(鉴定为SAU)135株,135株凝集法阳性菌中最后确认为SAU 127株,321株凝集法阴性菌最后确认为SAU11株,乳胶凝集法鉴定金黄色葡萄球菌灵敏度92.0%,特异性97.5%;Slidex MRSA Detection乳胶快速检测138株SA的PBP2a,阳性52株,138株SAU经苯唑西林筛选试验及PCR测定mceA基因,确定MRSA57株,乳胶凝集法快速检测SAU的PBP2a确定MRSA,灵敏度91.2%,特异性100%。结论单克隆抗体乳胶凝集法快速检测SAU及鉴定MRSA,具有较高灵敏度和特异性。