重组环状胸腺五肽结构类似物Cyclo-(Cys-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-)的制备、鉴定和活性检测

为了实现蛋白内含肽(Intein)介导的重组环状胸腺五肽结构类似物[cyclo-(Cys-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-),cTP]的高效制备,设计并合成编码6个氨基酸的cTP基因,克隆到表达载体pTWIN1,重组表达质粒pTW-cTp转化E.coliER2566构建工程菌,IPTG诱导由几丁质结合域纯化标签(chitinbindingdomain,CBD)、2个蛋白内含肽和目的多肽组成的“多元”融合蛋白(CBD-intein1-cTP-intein2-CBD)的高效表达.几丁质柱亲合层析纯化融合蛋白后,改变pH值和温度诱导intein1C端切割,硫醇MESNA诱导intein2N端切割,释放N端为Cys,C端为硫酯的重组cTP线性前体,通过非保护多肽硫酯环合法实现环肽生成.激光飞行质谱结果显示,纯化产物的分子量为764·4,与环肽的理论值相符.免疫活性检测结果显示,环肽cTP较线性多肽TP-5具有更显著的促进巨噬细胞吞噬能力的活性(P<0·01)和促进B细胞抗体生成的活性(P<0·01).