2021—2023年云南省麻栗坡县口蹄疫血清学监测及分析

为了解云南省中越边境麻栗坡县家畜口蹄疫(FMD)免疫情况,2021—2023年采集麻栗坡县猪、牛、羊血清样品4846份,分别采用口蹄疫病毒(FMDV)O型/A型ELISA抗体检测试剂盒及非结构蛋白3ABC阻断ELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。结果显示:麻栗坡县猪、牛和羊O型FMD免疫合格率为74.08%,牛和羊A型FMD免疫合格率为73.95%;不同畜种间O型FMD免疫合格率差异有统计学意义(P<0.05),牛、羊的A型FMD免疫合格率无显著差异(P>0.05);不同年份间,O型/A型FMD免疫合格率差异均有统计学意义(P<0.05);不同饲养规模间,规模场O型FMD免疫合格率显著高于散养户,差异具有统计学意义(P<0.05),牛规模场A型FMD免疫合格率明显高于散养户(P<0.05)。FMDV非结构蛋白抗体结果显示:猪、牛、羊感染抗体阳性率分别为1.30%、16.29%、16.99%,牛和羊的抗体阳性率显著高于猪,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明:麻栗坡县猪、牛、羊FMD整体免疫合格,但存在不同程度的FMDV感染。建议持续加强FMD疫苗免疫和免疫效果评估,强化血清学和病原学监测,及时掌握FMDV畜间感染情况,防控边境地区FMD流行,降低向内地散播风险。

上海市松江区猪口蹄疫病毒3ABC抗体血清学调查

为摸清上海市松江区2020-2022年猪口蹄疫感染情况,采集有代表性的规模场和专业户的猪血清样品共1 505份,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法进行猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体检测,结果阳性样品32份,阳性率2.13%。规模场、专业户阳性率分别为1.16%、3.78%。

区分动物疫苗免疫与病毒感染的口蹄疫非结构蛋白3AB鉴别诊断试剂盒的研制

以口蹄疫非结构蛋白3AB作为抗原的ELISA,适用于鉴别诊断感染和注苗动物。以3ABC基因片段为模板,经RT-PCR扩增得到3AB基因片段,与pET32a连接后,转化宿主菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,表达的重组3AB蛋白,分子量约为50Ku,ELISA结果显示,重组3AB蛋白可用于猪、牛口蹄疫病毒感染与疫苗免疫抗体的鉴别诊断。

应用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物

口蹄疫（Foot and Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的以感染牛、猪、羊等偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须通报的多种动物共患传染病之一。

免疫层析试纸条检测口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的研究

为建立口蹄疫(FMD)快速检测方法,本研究以纯化的FMD病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3ABC作为捕捉抗原,金标FMDV抗原作为金标试剂,建立了检测FMDNSP3ABC抗体的胶体金免疫层析试纸条(ICS)。应用FMDICS试验与UBIFMDNSP酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对反刍动物、猪的FMD标准阳性血清的不同滴度进行测定,结果表明ICS在检测反刍动物血清时的检测下限(1∶64)与ELISA(1∶128)接近,而检测猪血清时的检测下限(1∶8)低于UBINSP-ELISA试剂盒(1∶64)。同时用ICS和UBINSP-ELISA检测313份牛血清和111份羊血清,结果ICS检测牛血清时的敏感性和特异性分别为81.81%和96.69%,检测羊血清时敏感性和特异性分别为88.88%和95.10%;ICS与UBINSP-ELISA用于检测牛血清时符合率为95.52%,用于检测羊血清时的符合率为94.59%。结果表明ICS适合在基层单位或养殖场进行自行检测。

口蹄疫疫苗非抗原蛋白对146S抗原免疫效果的影响

为探究非抗原蛋白对口蹄疫病毒A型(FMDV-A) 146S抗原免疫效果的影响,本研究以小鼠和猪为试验动物,分别制备5组小鼠注射用样品:A组(3μg 146S抗原)、B组(3μg 146S抗原+25μg非抗原蛋白)、C组(3μg 146S抗原+50μg非抗原蛋白)、D组(3μg 146S抗原+100μg非抗原蛋白)及E组(空白对照,PBS);同时制备4组猪注射用样品:A组(18μg 146S抗原)、B组(18μg 146S抗原+400μg非抗原蛋白)、C(18μg 146S抗原+4 000μg非抗原蛋白)及D组(空白对照,PBS)。免疫接种试验动物后,通过淋巴细胞增殖试验及实时荧光定量PCR评价比较不同疫苗样品组小鼠产生的细胞免疫应答水平,同时通过液相阻断ELISA方法检测、评价各试验组动物(小鼠和猪)产生的体液免疫应答水平。小鼠试验结果显示,在免疫后3个检测时间点内,4个试验组中C组的平均抗体水平最高,平均抗体效价分别为4.13、5.83和5.50,而D组的抗体水平最低,平均抗体效价分别为3.46、5.16和4.46;C组细胞增殖能力及Th-1型细胞因子IL-6、IFN-β和TNF-αmRNA表达量均高于其他组。猪试验结果显示,A组和B组间平均抗体水平差异不显著(P>0.05),但A组和B组的平均抗体效价均极显著高于C组(P<0.01)。综合上述结果表明,一定范围内少量非抗原蛋白对FMDV-A 146S抗原的免疫效果没有影响,而高浓度的非抗原蛋白则抑制FMDV-A 146S抗原的免疫效果。

牛血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法的建立

为研究快速定量检测牛血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的方法,试验通过优化抗原表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中表达可溶性的3A-3B融合蛋白,并基于纯化的可溶性融合蛋白建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒。结果表明:建立的方法能够检测牛血清中的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的牛类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数分别低于10%和15%,具有良好的重复性。对300份临床牛血清样品进行检测,同Procheck公司的口蹄疫非结构蛋白抗体试剂盒进行比较,阳性样品符合率96%,阴性样品符合率93.3%,总的符合率95.7%。重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。文章首次建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法,同传统的ELISA方法相比,该检测方法特异性相当、敏感性更高,操作更简单、快速,具有较高的应用推广价值。

江苏省海门市猪A型口蹄疫非免疫抗体调查与分析

近年来,我国部分地区连续发生多起猪A型口蹄疫疫情,给畜牧业健康发展带来了隐患。针对当前猪A型口蹄疫防控形势,在海门市选择了部分规模猪场、种畜场、屠宰场,采集种猪、仔猪、育肥猪的血清,开展A型口蹄疫非免疫抗体调查。结果显示:调查猪群中猪A型口蹄疫非免疫抗体均呈阴性,调查猪群中未发现猪A型口蹄疫疫情。

口蹄疫病毒非结构蛋白3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测

【目的】口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测。【方法】利用原核表达系统表达了FMDV NSP 3A、3B和富含B细胞抗原位点序列的2C蛋白。利用高浓度尿素裂解包涵体,采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对2C蛋白进行复性。用金属鳌合亲合层析的方法对表达的FMDV NSP 3A、3B和2C进行纯化。采用ELISA方法对比检测了3种纯化蛋白在检测羊血清NSP抗体的效果。【结果】检测得知3A和3B为可溶性表达蛋白,2C以包涵体形式表达。通过Western-blot分析,表明纯化后蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应。纯化的3A、3B和复性后的2C融合蛋白与3ABC抗原的检测结果具有很高的符合性。【结论】该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫电转移印迹技术(EITB)提供了所需的材料。

呼伦贝尔犊牛免疫前后口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测结果对比分析

口蹄疫（footandmouthdisease，FMD）是一种高度接触性病毒传染病，传播速度快，发病率高，可对养殖业造成巨大的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列入A类动物传染病之列，我国农业部将其作为一类动物疫病中的重点重大动物疫病。目前，我国口蹄疫的主要防治措施依然是以灭活疫苗免疫为主，如何有效区分感染抗体与免疫抗体一直以来都是口蹄疫防控工作中亟待解决的重要难题。

口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因的克隆表达及3B-EL ISA鉴别诊断方法的初步建立

从口蹄疫病毒(foot-and-m ou th d isease v irus,FM DV)细胞培养物中提取总RNA,经一步法RT-PCR获得了长约230 bp的3B基因片段,将PCR产物连接到pM D-18T载体上并测序,用B amHⅠ与H indⅢ双酶切后,将3B基因融合到pGEX-KG载体上形成表达质粒pGEX-KG-3B,转化到BL 21(DE 3)中在27℃诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质斑点EL ISA。结果表明3B基因主要以可溶形式高效表达,表达产物具有免疫原性。以纯化的表达产物为抗原建立了间接酶联免疫吸附试验(I-EL ISA)。方阵滴定其最佳包被浓度是6.1μg/孔,最佳血清稀释倍数为1∶80,通过测定36份FM DV阴性血清,确定了该方法的阳性判定标准。结果表明,该方法特异性强、重复性好;用3B-EL ISA方法与美国联合生物医学公司(U B I)生产的合成肽检测试剂盒U B I○RFM DV N S-EL ISA对比检测44份血清样品,符合率为93.1%。证明3B-EL ISA方法可用于口蹄疫的鉴别诊断。

猪口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗不同首免日龄对免疫效果影响测定

为评价猪口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗不同首免时间对免疫效果的影响,选择二组不同日龄试验猪只进行免疫接种,接种疫苗当天采集试验猪血样测定母源抗体水平,并分别在首免和二免后不同间隔时间采集血样,分别用口蹄疫液相阻断ELISA和非结构蛋白抗体ELISA方法检测猪O型、A型口蹄疫抗体和非结构蛋白抗体水平。结果显示:40日龄首免的猪只,一免后31 d,A型和O型口蹄疫抗体阳性率分别为94.12%和100%,二免后60 d,分别为31.58%和36.84%;70日龄首免的猪只,一免后30 d,A型和O型口蹄疫抗体阳性率均为100%,二免后54 d,均为97.96%。表位缺失疫苗免疫后,两个试验猪群口蹄疫非结构蛋白抗体均为阴性。结果表明:70日龄首免的猪群,其口蹄疫O型和A型抗体阳性率较同期40日龄首免的猪群高,说明母源抗体水平低的仔猪对该疫苗的免疫应答水平更高。

口蹄疫非结构蛋白抗体假阳性现象分析

在开展口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测时,经常会有假阳性出现,这阻碍了对口蹄疫防控形势的科学判断,无形中增加不必要的工作负担。本试验通过对牛群进行口蹄疫病毒非结构蛋白抗体及口蹄疫病毒免疫抗体检测,发现假阳性出现的原因,并对假阳性出现的持续性进行分析。

口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗免疫安全性和抗体消长规律研究

为摸清口蹄疫0型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗免疫安全性和抗体消长规律,对试验猪群进行免疫,观察其健康状况,采用口蹄疫非结构蛋白ELISA检测非结构蛋白抗体,采用液相阻断ELISA检测0型和A型口蹄疫抗体。结果显示,疫苗免疫后,猪群健康状况良好,各时间点口蹄疫非结构蛋白抗体均为阴性;免疫前、一免后29 d、61 d、95 d、123 d,二免后30 d、64 d、92 d,A型口蹄疫抗体阳性率分别为7.14%、100%、100%、100%、100%、100%、100%和100%,0型口蹄疫抗体阳性率分别为0、100%、100%、100%、100%、100%、100%和100%。表明该疫苗免疫猪只后,安全性好,不会诱导动物机体产生口蹄疫非结构蛋白抗体,诱导产生的高水平A型、0型口蹄疫抗体可以维持较长时间,实施一免可维持至少4个月,实施二免可维持至少3个月。

口蹄疫病毒结构蛋白抑制宿主天然免疫应答的功能及机制

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)感染引起偶蹄动物的一种烈性传染病,严重危害我国及世界畜牧业发展。为突破宿主免疫应答,FMDV通过自身编码的多种结构蛋白和非结构蛋白拮抗宿主天然免疫和适应性免疫应答以达到免疫逃逸的目的。FMDV结构蛋白VP1是一种具有结合宿主细胞、诱导体液免疫应答和引起细胞凋亡的多功能蛋白。宿主肿瘤进行性位点2(TPL2)是一种重要的宿主免疫调节蛋白,可以调控宿主干扰素和细胞因子的产生,在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。

口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-Ⅲ株)纯度、免疫持续期、攻毒保护的研究

用口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-Ⅲ株)免疫12头6~9月龄口蹄疫抗体阴性牛,28日后二免,分别于接种后5 d、28 d、56 d、85 d、110 d采血,测定口蹄疫病毒非结构蛋白(NSPs)抗体及口蹄疫O型、A型ELISA抗体水平,并进行攻毒试验。试验牛免疫后5 d、28 d、56 d NSPs抗体阴性,疫苗纯度高。口蹄疫O型、A型ELISA效价28 d-110 d维持较高水平且达到99%以上保护效力,OHM/02株、A/XJNC/2010株攻毒100%保护,免疫过程安全性良好,无不良反应。