非全长链合成导致连续聚合酶链式反应(PCR)扩增失败和复杂产物的形成

在进行连续PCR(以产物为模板进行多轮次的连续重复PCR扩增)实验时,我们观察到了一种新的异常现象——用不同来源的模板连续PCR扩增不同长度的靶序列最终都会导致扩增失败,表现为在常规琼脂糖电泳检测时特异产物条带的消失和不能泳动出点样孔之复杂异常产物的出现.连续PCR扩增失败的时期依扩增靶序列的长度不同而不同,越长的靶序列在连续PCR中扩增失败的时期越早.扩增得到的复杂产物主要由连续分布的小于靶序列长度的具有相当程度多样性的非全长链组成.复杂产物在内部具有局部的双链区域和大量的单链区域而在外部具有单链分支结构,能够被单链特异的S1核酸酶消化,但是不能被双链特异的限制性内切酶消化.人工处理完整双链形成的非全长链长产物与完整双链以不同比例混合后作为模板进行连续PCR,结果表明同源的非全长链成分对PCR扩增有严重的干扰作用.已有的证据表明PCR扩增过程中形成的非全长链成分是导致这种异常现象的关键因素,多个不同长度的非全长链复性形成“杂种分子”最终表现为复杂产物.连续PCR扩增失败、PCR介导重组和长片段PCR难于操作有共同的产生基础——扩增过程中非全长链成分的产生.任何降低PCR扩增过程中非全长链成分产生的措施,特别是聚合酶忠实性的提高,都能缓解异常扩增产物的出现和利于长片段PCR操作.