非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测新疆特种乳中掺加的牛乳

新疆特种乳资源丰富,具有重要的商业价值。近年来乳制品掺假问题时有发生,准确鉴别特种乳中乳源动物成分,防止牛乳掺假具有重要的意义。本研究采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)对驼乳、马乳、驴乳、山羊乳与牛乳等特种乳的乳清蛋白及酪蛋白进行乳间差异性分析,建立基于牛乳特征蛋白质多态性的检测方法,并研究不同热处理工艺对检测方法稳定性、灵敏度的影响。结果表明,牛β-乳球蛋白可作为特种乳中掺加牛乳的检测靶标,热处理会使样品中蛋白质发生变性,导致掺加牛乳检出限的升高。基于牛β-乳球蛋白的条带强度与牛乳掺加百分比建立回归方程,相关系数为0.9779~0.9998,定量范围在5%~100%之间。本研究为新疆特种乳中掺加牛乳的检测,提供了一种准确、灵敏和经济的方法。

一种半变性琼脂糖凝胶电泳技术的改良

建立一种经济快捷的利用半变性琼脂糖凝胶电泳技术分析酵母朊病毒迁移特性的方法,在蛋白样品制备过程中采用珠磨破碎法代替文献使用的昂贵的藤黄节杆菌酶酶解法破碎酵母细胞,使用TBE代替文献使用的TAE作为电泳缓冲液,并使用电湿转法代替文献使用的毛细虹吸法转印蛋白。对酵母朊病毒[PSI+]的朊蛋白迁移特性分析结果显示,改良法不影响文献法的准确性,但降低了实验成本,缩短了实验时间。

非浓缩尿蛋白SDS-琼脂糖凝胶电泳技术及临床应用

目的对尿液中各种蛋白质进行分离,用于区分尿蛋白的类型。方法应用十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶电泳(SDS-AGE)法进行非浓缩尿蛋白电泳,对40例已被临床确诊的肾脏疾病患者的尿液样本进行电泳分析,使尿蛋白按分子量大小进行分离。结果根据尿蛋白分子量大小可以将其区分为肾小球性、肾小管性、混合性、溢出性及生理性蛋白尿。其中肾小球性蛋白尿13例、肾小管性蛋白尿9例、混合性蛋白尿11例、溢出性蛋白尿2例、生理性蛋白尿5例。结论本法具有分离效果好,检测灵敏度和诊断符合率高,操作简便,速度快,胶片易于保存等优点。可以将尿蛋白按分子量大小进行区分,经EDC扫描后可获半定量结果,对肾脏疾病的受损部位和受损程度的判断具有较高的价值。

高粱微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件的优化

以高粱抗、感丝黑穗病3号生理小种部分品种(S95062B、7050B、2381R、LR625;622A、622B、矮4)为材料,利用微卫星标记结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行抗病基因的引物筛选。通过比较各因子对电泳体系的影响,建立了一个高粱微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的优化体系:电泳时间为92～105min;银染温度为27.8～29.0℃;显色温度为32℃左右。

蛋白质复合体非变性凝胶电泳技术及其应用新进展

非变性凝胶电泳技术是研究蛋白质复合体的强有力工具。重点介绍了蓝绿温和非变性凝胶电泳(BN-PAGE)技术的原理和特点,比较了由BN-PAGE衍生的蓝色温和琼脂糖凝胶电泳、清澈温和非变性凝胶电泳(CN-PAGE)和高分辨清澈温和非变性凝胶电泳(HrCN-PAGE)技术的差异和适用范围,并概括地介绍了这些技术在植物蛋白质复合体研究中应用的新进展。

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物的观察

目的 :观察采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化目的 PCR产物的效果。方法 :使用不同的 31对引物 ,4 5例标本行 PCR扩增出不同的目的 DNA片段 ,将每一份 PCR产物分为 2份 ,其中 1份直接测序 ,为对照组 ;另 1份则做非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,以分离出的目的 DNA片段单链为模板行 2次 PCR,对 2次 PCR产物测序 ,此为实验组。结果 :实验组只有 4例不能被测序仪判读 (4 / 4 5 ) ,而对照组有 2 4例不能被测序仪判读 (2 4 / 4 5 ) ,两组比较 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 1 )结论 :根据单链DNA片段形成构象的不同来纯化

非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法临床应用探讨

目的:建立一种省时简便和灵敏可靠的检测筛查基因点突变的方法,即PCR-SSCP(PCR-Singlestrandconformationpolymorphism)银染分析技术。方法:应用改进的PCR-SSCP银染分析技术,检测妊娠期胆内胆汁淤积症患者外周血基因组DNA中MDR3基因外显子14的点突变情况。结果:非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳在有冷水循环装置控制下,结果稳定可靠,受环境温度影响小;但银染时,需根据室温调整染色时间及显影液的配制,当室温高于25℃时,碳酸钠需预冷,有利于控制背景色,得到更为满意的结果。结论:利用非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法筛查目的基因的点突情况,具有省时简便和灵敏可靠的特点,且重复性好,避免了盲目测序及资金浪费。

血红蛋白全自动琼脂糖凝胶电泳在β地中海贫血中的应用及评价

目的 评价全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳在 β地中海贫血中的应用。方法 采用全自动琼脂糖凝胶进行血红蛋白 (Hb)电泳 ,测定 Hb- A2 及 Hb- F含量 ,同时采用 Hb- F碱变性试验对同一标本进行Hb- F含量测定 ,比较二种方法对 Hb- F含量的检测结果。结果 检测临床标本 80 0例 ,发现 Hb- A2 增高者 (含量 >4% ) 1 3 0例 ,阳性率为 1 6 .3 %。测定 Hb- A2 的批内 CV<5 % ,批间 CV<8%。同时伴有 Hb- F增高者 5 0例。对于 Hb- F碱变性试验测得 Hb- F含量异常高者 (含量 >3 .1 % ) ,琼脂糖凝胶电泳可以分辨出Hb- F区带 ,且可进行扫描定量 ,测出的 Hb- F含量与 Hb- F碱变性试验基本一致 ;如 Hb- F碱变性试验测定 Hb- F含量在正常范围者 (1 .0 %～ 3 .0 % ) ,电泳便分辨不出 Hb- F区带 ,与 Hb- A一起组成 Hb- (A+F)区带。结论 全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳法能够分辨出 Hb- A2 及 Hb- F异常增高者 ,为 β地中海贫血的诊断提供重要数据。

大白菜非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术影响因素研究

电泳技术是分子标记辅助育种技术的关键步骤,建立一套高效的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术体系可提高分子标记辅助育种技术的工作效率。以根肿病抗感大白菜作为试材,以凝胶聚合速度及凝胶条带的清晰度作为衡量标准,分别对电泳中的凝胶浓度、温度、促凝剂配比3个重要因素进行研究。结果发现凝胶浓度、温度、促凝剂配比均与凝胶聚合时间呈现负相关,但4种常用凝胶浓度制胶时间差异不明显,可主要根据目的产物的大小选择浓度。在凝胶质量方面,温度、促凝剂配比与凝胶的脆性呈负相关。综合分析,操作中环境温度为25~35℃,促凝剂配比为1∶10的条件,聚合速度适中,条带清晰,检测效果最佳。

木薯SSR标记非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件的优化

以木薯品种为材料,利用微卫星标记结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行木薯重要农艺性状基因的引物筛选。通过比较各因子对电泳体系的影响,建立了一个木薯微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的优化体系:TEMED用量为80μL,10%AP用量为1 200μL,电泳时间为60～90 min。

基于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的菜心SCoT分析

以菜心(Brassica rapa var.parachinensis)抗小菜蛾品种Caixin65和感小菜蛾品种Caixin69及6份F2株系为材料,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测菜心抗虫株系的SCoT多态性,同时进行SCoT多态性的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测效率、遗传多样性分析和差异条带克隆分析。结果表明,非变性聚丙烯酰胺凝胶能检测出亲本与子代间的SCoT多态性和遗传多样性变化,条带数量较多且清晰,提高了SCoT标记检测效率。选取亲本的10条非变性聚丙烯酰胺凝胶差异片段克隆测序,获得感虫序列4条、抗虫序列6条,GENSCAN预测其中8条具有启动子、终止子、阅读框等基因结构序列。同源性检索分析表明,感虫序列分别与泛素羧基末端水解酶mRNA序列、大白菜克隆序列、白菜线粒体丙酮酸载体蛋白序列、甘蓝基因组编码未知蛋白的HDEM序列同源,抗虫序列分别与白菜RNA假尿苷合酶4线粒体mRNA序列、京水菜线粒体DNA序列、白菜未知蛋白mRNA序列、白菜4-香豆酸:辅酶A连接酶mRNA序列、大白菜克隆序列、哈茨木霉mRNA序列同源。本研究提高了SCoT标记清晰度、遗传多样性检测水平和差异片段克隆的精准性,使得SCoT成为批量克隆差异片段的高效工具,有助于挖掘SCoT功能性标记信息,开展初步的功能基因组学研究,提高优异株系筛选鉴定效率,加快育种进程,为菜心抗虫性机制的进一步研究提供理论基础。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在大鼠海马组织蛋白分离中的应用

目的 :探索应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大鼠海马组织蛋白的最佳条件。方法 :选用不同 p H的正极缓冲液和样品蛋白上样量 ,应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大鼠海马组织蛋白质。结果 :在其它条件不变的情况下 ,p H9.0的正极电泳缓冲液以及 40～ 6 0 μg/孔样品蛋白上样量时 ,可得到分辨率高、条带多而清晰的电泳图谱。结论 :应用 p H9.0的正极电泳缓冲液和样品上样量为 40～ 6 0 μg/孔时 ,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,可成功地分离大鼠海马组织蛋白。

全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳在β地中海贫血的临床应用

目的 :讨论全自动血红蛋白 (Hb)琼脂糖凝胶电泳在 β地中海贫血中的临床应用。 方法 :采用全自动琼脂糖凝胶进行血红蛋白电泳 ,测定Hb -A2 、、Hb -F含量 ,且同时用碱变性试验对其进行检测 ,比较两种方法的检测结果。结果 :检测抗凝血标本 385例 ,发现Hb -A2 增高者 (含量 >4 % ) 5 0例 ,阳性率 13.9% ,同时伴Hb -F增高者 2 0例。Hb -F碱变性试验测的Hb -F含量增高 (含量 >3.1% )。琼脂糖凝胶电泳可分辨出Hb -F区带 ,定量扫描测出的含量与Hb -F碱变性试验基本一致 ;如Hb -F碱变性试验测定Hb -F含量在正常范围者 (1～ 3% )电泳分辨不出Hb -F区带 ,与Hb -A一起组成Hb - (A +F)区带。结论 :全自动Hb琼脂糖凝胶电泳能够清晰分辨出Hb -A2 和Hb -F增高者 ,为地中海贫血的诊断提供重要的数据。

应用非变性聚丙烯凝胶电泳筛选siRNA质粒的实验研究

目的探讨利用非变性聚丙烯凝胶电泳筛选TGF-β1特异性siRNA表达质粒。方法以高表达TGF—β1人肺腺癌细胞株A549为肿瘤细胞模型。应用Angela原则选择siRNA序列，12％非变性聚丙烯凝胶电泳筛选siRNA表达质粒并经测序后转染A549细胞，间接免疫荧光和免疫印迹法检测转染前后A549细胞中TGF-β1表达水平。结果经典分子克隆方法成功构建pOligo1210、pOligo1216、pOligo1363。12％非变性聚丙烯凝胶可以清晰地分辨出被双酶切的插入片段。转染A549细胞后均产生特异性的表达抑制效应，抑制率为50％～83．2％。结论采用非变性聚丙烯凝胶电泳成功筛选出TGF—β1为靶点的siRNA表达质粒，并可广泛应用于筛选siRNA质粒。

癸基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析非变性蛋白质分子量的适用性鉴定

目的:鉴定癸基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDecS-PAGE)是否适于分析非变性蛋白质的分子量。方法:以不同SDecS-PAGE凝胶、电泳缓冲液分析5种非变性标准分子量蛋白质,观察蛋白质亚基解离情况,测定分子量对数值(log Mr)与迁移率x之间的相关性。结果:5种标准分子量蛋白质的四级结构完整,log Mr与x线性相关性较低;但其中的α-牛乳白蛋白、鸡蛋清白蛋白、牛血清白蛋白的log Mr与x线性相关性较好,相关系数平方值(R2)>0.94。结论:SDecS-PAGE可用于测定有限种类的非变性蛋白质的分子量。

几种鲑鳟鱼血清蛋白非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的研究

采用非变性聚丙烯凝胶电泳的方法分析了硬头鳟、金鳟、虹鳟、北极红点鲑和溪红点鲑血清蛋白的组成成分及其含量。结果显示,硬头鳟、金鳟和虹鳟三者之间的遗传距离最小,硬头鳟、金鳟和虹鳟三者与溪红点鲑的遗传距离最大;硬头鳟、金鳟和虹鳟三者与北极红点鲑处于同一亚组,而溪红点鲑独处于另一亚组。研究结果表明硬头鳟、金鳟和虹鳟三者与溪红点鲑的亲缘关系远于与北极红点鲑的关系;同时还表明,以聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鲑鳟鱼血清蛋白的方法简单易行、重复性好。本研究结果对鲑鳟鱼的种属鉴定、良种选育、品种改良和遗传结构分析提供了试验依据;虹鳟的繁养殖需进一步规范化和标准化,减少蛋白遗传基因的流失,从根本上预防大规模疾病的暴发。

2000例全自动琼脂糖凝胶电泳检测血红蛋白异常结果分析

目的 分析 2 0 0 0例血红蛋白电泳结果 ,探讨全自动琼脂糖凝胶电泳在地中海贫血中的应用。方法 采用全自动琼脂糖凝胶进行血红蛋白 (Hb)电泳 ,测定异常Hb、HbA2 及Hb -F含量 ,同时采用Hb -F碱变性试验对同一标本进行Hb -F含量测定。结果 检测临床标本 2 0 0 0例 ,发现异常Hb 90例 ,其中HbH2 6例 ,HbBart′s 5 6例 ,HbE2 例 ,其它异常Hb快速带 6例。测定HbA2 含量的批内CV <5 % ,批间CV <8%。发现HbA2 增高者 (含量 >4 .0 % ) 14 0例 ,同时伴有HbF增高者 6 0例。对于HbF碱变性试验测得HbF含量异常高者 (含量 >3.1% ) ,琼脂糖凝胶电泳可以分辨出HbF区带 ,且可进行扫描定量 ,测出的HbF含量与HbF碱变性试验基本一致。结论 全自动琼脂糖凝胶电泳分辨率极高 ,能够分辨出极微量异常Hb ,准确分析出HbA2 及HbF异常增高者 ,为地中海贫血的诊断提供准确可靠的数据。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析切割海马伞大鼠海马组织蛋白

目的 :应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统研究切割海马伞后大鼠海马组织蛋白的生化改变 ,为分离、纯化海马中诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的信号物质奠定基础。方法 :取SD大鼠 ,行单侧切割海马伞术 ,于术后不同时期取切割侧海马和正常侧海马组织。进行 10 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。观察切割海马伞海马和正常海马的蛋白表达差异。结果 :两者在低分子量区存在一条差异性蛋白条带。其中正常海马组织的条带染色最浅 ,切割海马伞海马组织中 10天组和 2 0天组染色较深 ,14天组染色最深。结论 :结合我们过去实验 ,本研究中切割海马伞海马及正常海马组织蛋白出现的差异性条带中 。

生物素标记探针-液相杂交-非变性PAGE检测非编码小RNA方法的建立和优化

目的建立生物素标记探针-液相杂交-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测非编码小RNA(sRNA)的方法。方法将生物素标记的sRNAU6寡核苷酸探针经非变性PAGE电泳后转印至尼龙膜上,然后用辣根过氧化物酶(HRP)耦联链霉亲和素进行检测。从细胞中提取总RNA,用已标记U6探针优化液相杂交退火条件及杂交缓冲液;用建立的方法检测并计算BEAS-2B、A549细胞中sRNAU6与miRNA145的含量。结果将Biotin-11-dUTP成功标记至寡核苷酸上,随着寡核苷酸浓度增加,检测信号强度越强,10μmol/L时达到最强。采用水浴反应条件与采用聚合酶链反应(PCR)仪梯次降温反应条件下得到的杂化链无明显差异;以磷酸盐缓冲液作为杂交缓冲液优于Tris-HCl、DEPC水;BEAS-2B、A549细胞5μgRNA中U6含量接近;BEAS-2B细胞中miRNA145绝对含量高于A549细胞。结论成功建立并优化了sRNA检测新方法 ,为简单、易行、可靠地检测sRNA提供了可能。

全自动血红蛋白电泳与Hb-F碱变性试验在β地中海贫血中的应用及评价

目的 评价全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳与Hb—F碱变性试验在口地中海贫血中的应用。方法 采用全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳仪进行血红蛋白（Hb）电泳，测定Hb—A2及Hb-F含量，同时采用Hb—F碱变性试验对同一标本进行Hb—F含量测定．比较两种方法对Hb—F含量的检测结果。结果 检测了30例临床标本，发现Hb—A2增高者（含量〉4％）5侧，阳性率〉16．7％，测定Hb-A2的批内CV〈6％，批间〈9％。同时检测出Hb-F含量增高3例。对于Hb-F碱变性试验测得Hb—F含量增高者（含量〉3．1％），通过全自动琼脂糖凝胶电泳可以分辨出HbF区带，并且能进行定量扫描，测出的Hb—F含量与Hb-F碱变性试验测得Hb—F含量基本一致；如果Hb—F碱变性试验测得Hb-F含量在正常范围内（1.0％～3.0％），电泳就不能分辨出HbF区带。结论 全自动血红蛋白琼脂糖凝胶电泳法能够分辨出Hb—A2及Hb—F异常增高者，为β地中海贫血的诊断提供重要的数据。