应用非变性聚丙烯凝胶电泳筛选siRNA质粒的实验研究

目的探讨利用非变性聚丙烯凝胶电泳筛选TGF-β1特异性siRNA表达质粒。方法以高表达TGF—β1人肺腺癌细胞株A549为肿瘤细胞模型。应用Angela原则选择siRNA序列，12％非变性聚丙烯凝胶电泳筛选siRNA表达质粒并经测序后转染A549细胞，间接免疫荧光和免疫印迹法检测转染前后A549细胞中TGF-β1表达水平。结果经典分子克隆方法成功构建pOligo1210、pOligo1216、pOligo1363。12％非变性聚丙烯凝胶可以清晰地分辨出被双酶切的插入片段。转染A549细胞后均产生特异性的表达抑制效应，抑制率为50％～83．2％。结论采用非变性聚丙烯凝胶电泳成功筛选出TGF—β1为靶点的siRNA表达质粒，并可广泛应用于筛选siRNA质粒。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测新疆特种乳中掺加的牛乳

新疆特种乳资源丰富,具有重要的商业价值。近年来乳制品掺假问题时有发生,准确鉴别特种乳中乳源动物成分,防止牛乳掺假具有重要的意义。本研究采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)对驼乳、马乳、驴乳、山羊乳与牛乳等特种乳的乳清蛋白及酪蛋白进行乳间差异性分析,建立基于牛乳特征蛋白质多态性的检测方法,并研究不同热处理工艺对检测方法稳定性、灵敏度的影响。结果表明,牛β-乳球蛋白可作为特种乳中掺加牛乳的检测靶标,热处理会使样品中蛋白质发生变性,导致掺加牛乳检出限的升高。基于牛β-乳球蛋白的条带强度与牛乳掺加百分比建立回归方程,相关系数为0.9779~0.9998,定量范围在5%~100%之间。本研究为新疆特种乳中掺加牛乳的检测,提供了一种准确、灵敏和经济的方法。

大白菜非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术影响因素研究

电泳技术是分子标记辅助育种技术的关键步骤,建立一套高效的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术体系可提高分子标记辅助育种技术的工作效率。以根肿病抗感大白菜作为试材,以凝胶聚合速度及凝胶条带的清晰度作为衡量标准,分别对电泳中的凝胶浓度、温度、促凝剂配比3个重要因素进行研究。结果发现凝胶浓度、温度、促凝剂配比均与凝胶聚合时间呈现负相关,但4种常用凝胶浓度制胶时间差异不明显,可主要根据目的产物的大小选择浓度。在凝胶质量方面,温度、促凝剂配比与凝胶的脆性呈负相关。综合分析,操作中环境温度为25~35℃,促凝剂配比为1∶10的条件,聚合速度适中,条带清晰,检测效果最佳。

高粱微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件的优化

以高粱抗、感丝黑穗病3号生理小种部分品种(S95062B、7050B、2381R、LR625;622A、622B、矮4)为材料,利用微卫星标记结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行抗病基因的引物筛选。通过比较各因子对电泳体系的影响,建立了一个高粱微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的优化体系:电泳时间为92～105min;银染温度为27.8～29.0℃;显色温度为32℃左右。

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物的观察

目的 :观察采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化目的 PCR产物的效果。方法 :使用不同的 31对引物 ,4 5例标本行 PCR扩增出不同的目的 DNA片段 ,将每一份 PCR产物分为 2份 ,其中 1份直接测序 ,为对照组 ;另 1份则做非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,以分离出的目的 DNA片段单链为模板行 2次 PCR,对 2次 PCR产物测序 ,此为实验组。结果 :实验组只有 4例不能被测序仪判读 (4 / 4 5 ) ,而对照组有 2 4例不能被测序仪判读 (2 4 / 4 5 ) ,两组比较 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 1 )结论 :根据单链DNA片段形成构象的不同来纯化

非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法临床应用探讨

目的:建立一种省时简便和灵敏可靠的检测筛查基因点突变的方法,即PCR-SSCP(PCR-Singlestrandconformationpolymorphism)银染分析技术。方法:应用改进的PCR-SSCP银染分析技术,检测妊娠期胆内胆汁淤积症患者外周血基因组DNA中MDR3基因外显子14的点突变情况。结果:非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳在有冷水循环装置控制下,结果稳定可靠,受环境温度影响小;但银染时,需根据室温调整染色时间及显影液的配制,当室温高于25℃时,碳酸钠需预冷,有利于控制背景色,得到更为满意的结果。结论:利用非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法筛查目的基因的点突情况,具有省时简便和灵敏可靠的特点,且重复性好,避免了盲目测序及资金浪费。

大白菜非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的优化

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的检测效果受到凝胶聚合速度、片段迁移率等多种因素影响。以大白菜为供试材料,研究比较了凝胶聚合速度及PCR产物在不同浓度凝胶上的检测效果。不同浓度的凝胶是由2种〔40%(19∶1)和30%(29∶1)〕贮存液分别配制的4种浓度(5%,7%,9%,11%)。结果表明,在4～30℃,凝胶聚合速度随温度的升高而加快;APS保持不变,不同温度下TEMED∶APS合适配比也不同:4℃(冬季)时,TEMED/APS的合适配比是1∶10,25℃(春秋)、30℃(夏季),选择1∶20的配比为宜;2种不同贮存液配制的相同浓度凝胶检测效果不同,30%(29∶1)优于40%(19∶1),由前者配制7%的凝胶上DNA片段分离效果好,带型清晰,分辨率高。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在大鼠海马组织蛋白分离中的应用

目的 :探索应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大鼠海马组织蛋白的最佳条件。方法 :选用不同 p H的正极缓冲液和样品蛋白上样量 ,应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大鼠海马组织蛋白质。结果 :在其它条件不变的情况下 ,p H9.0的正极电泳缓冲液以及 40～ 6 0 μg/孔样品蛋白上样量时 ,可得到分辨率高、条带多而清晰的电泳图谱。结论 :应用 p H9.0的正极电泳缓冲液和样品上样量为 40～ 6 0 μg/孔时 ,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,可成功地分离大鼠海马组织蛋白。

木薯SSR标记非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件的优化

以木薯品种为材料,利用微卫星标记结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行木薯重要农艺性状基因的引物筛选。通过比较各因子对电泳体系的影响,建立了一个木薯微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的优化体系:TEMED用量为80μL,10%AP用量为1 200μL,电泳时间为60～90 min。

基于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的菜心SCoT分析

以菜心(Brassica rapa var.parachinensis)抗小菜蛾品种Caixin65和感小菜蛾品种Caixin69及6份F2株系为材料,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测菜心抗虫株系的SCoT多态性,同时进行SCoT多态性的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测效率、遗传多样性分析和差异条带克隆分析。结果表明,非变性聚丙烯酰胺凝胶能检测出亲本与子代间的SCoT多态性和遗传多样性变化,条带数量较多且清晰,提高了SCoT标记检测效率。选取亲本的10条非变性聚丙烯酰胺凝胶差异片段克隆测序,获得感虫序列4条、抗虫序列6条,GENSCAN预测其中8条具有启动子、终止子、阅读框等基因结构序列。同源性检索分析表明,感虫序列分别与泛素羧基末端水解酶mRNA序列、大白菜克隆序列、白菜线粒体丙酮酸载体蛋白序列、甘蓝基因组编码未知蛋白的HDEM序列同源,抗虫序列分别与白菜RNA假尿苷合酶4线粒体mRNA序列、京水菜线粒体DNA序列、白菜未知蛋白mRNA序列、白菜4-香豆酸:辅酶A连接酶mRNA序列、大白菜克隆序列、哈茨木霉mRNA序列同源。本研究提高了SCoT标记清晰度、遗传多样性检测水平和差异片段克隆的精准性,使得SCoT成为批量克隆差异片段的高效工具,有助于挖掘SCoT功能性标记信息,开展初步的功能基因组学研究,提高优异株系筛选鉴定效率,加快育种进程,为菜心抗虫性机制的进一步研究提供理论基础。

癸基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析非变性蛋白质分子量的适用性鉴定

目的:鉴定癸基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDecS-PAGE)是否适于分析非变性蛋白质的分子量。方法:以不同SDecS-PAGE凝胶、电泳缓冲液分析5种非变性标准分子量蛋白质,观察蛋白质亚基解离情况,测定分子量对数值(log Mr)与迁移率x之间的相关性。结果:5种标准分子量蛋白质的四级结构完整,log Mr与x线性相关性较低;但其中的α-牛乳白蛋白、鸡蛋清白蛋白、牛血清白蛋白的log Mr与x线性相关性较好,相关系数平方值(R2)>0.94。结论:SDecS-PAGE可用于测定有限种类的非变性蛋白质的分子量。

一种高效省本的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法的建立——以水稻为例

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染技术已广泛用于DNA片段检测。介绍一种本实验室改进的高效省本的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法,该法将固定和染色两步骤合并,整个银染过程只需16 min即可完成。同时,该法无需使用无水乙醇和冰乙酸,减少了硝酸银、氢氧化钠及甲醛的使用量。

几种鲑鳟鱼血清蛋白非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的研究

采用非变性聚丙烯凝胶电泳的方法分析了硬头鳟、金鳟、虹鳟、北极红点鲑和溪红点鲑血清蛋白的组成成分及其含量。结果显示,硬头鳟、金鳟和虹鳟三者之间的遗传距离最小,硬头鳟、金鳟和虹鳟三者与溪红点鲑的遗传距离最大;硬头鳟、金鳟和虹鳟三者与北极红点鲑处于同一亚组,而溪红点鲑独处于另一亚组。研究结果表明硬头鳟、金鳟和虹鳟三者与溪红点鲑的亲缘关系远于与北极红点鲑的关系;同时还表明,以聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鲑鳟鱼血清蛋白的方法简单易行、重复性好。本研究结果对鲑鳟鱼的种属鉴定、良种选育、品种改良和遗传结构分析提供了试验依据;虹鳟的繁养殖需进一步规范化和标准化,减少蛋白遗传基因的流失,从根本上预防大规模疾病的暴发。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析切割海马伞大鼠海马组织蛋白

目的 :应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统研究切割海马伞后大鼠海马组织蛋白的生化改变 ,为分离、纯化海马中诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的信号物质奠定基础。方法 :取SD大鼠 ,行单侧切割海马伞术 ,于术后不同时期取切割侧海马和正常侧海马组织。进行 10 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。观察切割海马伞海马和正常海马的蛋白表达差异。结果 :两者在低分子量区存在一条差异性蛋白条带。其中正常海马组织的条带染色最浅 ,切割海马伞海马组织中 10天组和 2 0天组染色较深 ,14天组染色最深。结论 :结合我们过去实验 ,本研究中切割海马伞海马及正常海马组织蛋白出现的差异性条带中 。

香菇微卫星标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用及正交优化

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种高效鉴定微卫星分子标记的方法,广泛应用于种质鉴定、遗传连锁图谱构建及分子标记辅助育种等研究中。该方法由于操作繁琐,目前在食用菌领域的应用尚不广泛。以香菇为研究对象,建立变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测流程,并利用正交试验对检测流程中涉及的加样缓冲液与PCR反应液的体积比、95℃变性时间、置于冰上冷却时间、银染时间、银染后胶板去离子水洗时间等5个操作节点进行优化。结果表明,加样缓冲液与PCR反应液体积比为1∶2,95℃变性2~5min,置于冰上冷却15~20min,银染7min,银染后胶板用去离子水洗5~10s是正交试验的较优处理组合。试验建立了香菇微卫星标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测操作规程,该操作规程具有成本低、效率高、易批量化操作等优点,对其他食用菌微卫星标记的应用具有重要的参考价值。

桑蚕丝蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳研究 Ⅰ.丝蛋白的非解离和解离系统电泳

本文用聚丙烯酰胺凝脉电泳法(PAGE),对桑蚕绢丝腺蛋白和茧丝蛋白进行了研究。测定了主要谱带的分子量,并进行了讨论。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定动物肌肉蛋白热变性的研究

分别对鸡、牛、猪、羊、鱼等五种新鲜动物肌肉组织进行不同温度的热处理,对处理前后的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示五种动物肌肉组织经不同温度处理,所得电泳图谱具有显著差异,反映蛋白质变性与温度存在密切相关性。因此,可采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定动物组织蛋白的热变性程度,从而应用于肉制品加工过程中热熟程度的判定。该方法特异性和敏感性较强,操作简单,结果判定直观可靠。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定动物肌肉蛋白热变性的研究

分别对鸡、牛、猪、羊、鱼等五种新鲜动物肌肉组织进行不同温度的热处理,对处理前后的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示五种动物肌肉组织经不同温度处理,所得电泳图谱具有显著差异,反映蛋白质变性与温度存在密切相关性。因此,可采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定动物组织蛋白的热变性程度,从而应用于肉制品加工过程中热熟程度的判定。该方法特异性和敏感性较强,操作简单,结果判定直观可靠。

一种快速有效检测SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法

聚丙烯酰胺凝胶银染法是一种具有高分辨率检测SSR标记的有效方法，然而传统的银染方法存在操作步骤较多、所需时间较长及试剂种类与用量较多等不足．本研究利用菜心和烟草SSR标记为研究对象，建立一种能快速有效检测其PCR扩增产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法．该方法包括染色和显影2个主要操作步骤，整个银染流程耗时6～7min，只需要AgNO3、NaOH和甲醛3种试剂，所检测SSR标记的DNA条带清晰、易辨．与其他银染法相比，本研究建立的银染法具有易于操作、耗时少、所需试剂种类和用量少及检测效果好的优势．

非聚丙烯酰胺凝胶电泳(Non-PAGE)的复杂蛋白质组表达分析:一种新的二维液相技术用于完整蛋白质的高通量分离分析

揭示基因组-转录子组-蛋白质组(Genome-transcriptome-proteome)的关系、描绘蛋白质翻译后修饰(PTM)的途径、常规地运用质谱(MS)技术进行蛋白质的定性和识别,这三方面的力量和需求将推动日后的新药开发.在过去的几年里,蛋白质定性和蛋白质组学研究的突飞猛进有赖于这三方面发展的相结合,这种整合成为生物技术研发(R&D)工作流程的一个典范.正如人类基因组计划的经验,研究生物相关体系中的复杂蛋白的表达同样亟待新的分析技术和手段.