烟色红曲霉Lig4基因克隆鉴定与蛋白序列分析

为了分离鉴定烟色红曲霉中可能编码非同源重组调控因子的Mflig4基因,先后通过简并引物PCR和染色体走读方法获得烟色红曲霉Mflig4基因,采用多种分子生物学软件对其基因序列和蛋白质性质等进行分析,并构建真菌Lig4蛋白的系统发育树。结果显示,Mflig4基因包括3个内含子,位置分别为70～155,2 244～2 363,2 436～2 526bp。Mflig4基因全长为3 120bp,编码基因为2 823bp。编码产物长度940aa,蛋白质分子量为104kDa,等电点为7.87,预测显示Mflig4蛋白在细胞中定位于细胞核中。对不同物种间Mflig4蛋白遗传进化树分析,发现烟色红曲霉的Mflig4蛋白在进化关系上与其它真菌都有较高的亲缘关系。

Yunnanese(~Aγδβ)~0-地贫缺失桥片段的克隆及缺失连接区的序列测定

为研究导致Ｙｕｎｎａｎｅｓｅ（Ａγδβ）０－地贫缺失事件的分子机制，并从３′并入序列中搜寻增强子类序列，使用ＥＭＢＬ３为载体构建了一例缺失杂合子的基因组文库，筛选到来源于异常染色体１１并包含Ｇγ珠蛋白基因区６．７ｋｂ序列以及１１．５ｋｂ３′并入序列（即缺失桥片段）的克隆．此１１．５ｋｂ序列在正常染色体中位于β珠蛋白基因约下游６６～７８ｋｂ区域．详细分析了这一区域的限制性内切酶图谱．分析了围绕缺失连接区的ＤＮＡ序列，精确定位缺失的５′端点发生在Ａγ珠蛋白基因上游－１１６～－１１７碱基之间．确定缺失的３′端点处于一个Ｌ１序列内，位于β珠蛋白基因下游～６６ｋｂ，距离Ｃｈｉｎｅｓｅ（Ａγδβ）０－地贫缺失３′端点上游～１２．２ｋｂ的一个ＥｃｏＲⅠ位点上游４１３ｂｐ．围绕５′和３′端点的序列之间无明显同源性，说明这一缺失代表了体内的非同源重组事件．这一重组事件可能由Ｌ１序列介导．

与真核生物DSBs修复有关的NHEJ途径研究进展

DNA双链断裂是真核生物最严重的DNA损伤形式。如果断裂的DNA双链无法及时修复,将可能导致细胞死亡。非同源末端连接途径在真核生物DSBs修复中起重要作用。综述了真核生物NHEJ途径中核心蛋白质Ku、DNA-PKcs、DNA连接酶IV、XRCC4、ARTEMIS和XIF等因子的结构和功能,并简要介绍了NHEJ修复途径的分子机制,其中涉及到DSBs位点蛋白复合体组装的两种模型。

DPY19L2基因与圆头精子症研究进展

圆头精子症是一种严重的畸形精子症,临床上100%圆头缺陷精子的病例比较少见,这类患者精液中精子头部呈圆形,一般无顶体或者顶体异常,可伴有杂乱的中段和尾部。由于顶体内含有精子和卵细胞受精所需要的酶类,这类异常的精子无论体内或体外都不易自主与卵细胞受精,因而圆头精子症患者临床表现为不育。最新研究表明,一种编码跨膜结构域蛋白基因DPY19L2(dpy-19-like 2)的缺失是导致圆头精子产生的主要原因。本文就DPY19L2与圆头精子症的研究进展做一概述,为圆头精子症的基因诊断和分子机制研究提供依据。

三种小分子化合物对猪胎儿成纤维细胞DNA精确修复效率的影响

旨在研究3种小分子化合物(RS-1、Chir99021和PD173074)对猪胎儿成纤维细胞DNA精确修复效率的影响。本研究以猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)为试验对象,利用HDR通路关键因子Rad51激活剂RS-1、Wnt信号通路关键因子糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3,GSK-3)抑制剂Chir99021和成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR1)抑制剂PD173074培养细胞,通过流式细胞术检测绿色荧光细胞数百分比来验证3种小分子化合物对DNA精确修复效率的影响。结果显示:1)经不同剂量的Chir99021和PD173074处理后,PFFs DNA损伤修复因子LIG4、NHEJ1、XRCC5、XRCC6和Rad51表达水平都显著下调(P <0. 05),而经不同浓度PD173074(0. 1～0. 5μmol·L^(-1))处理后,PNKP因子表达上调(P <0. 05)。2) Chir99021低剂量时可显著提高同源重组修复(homologous recombination,HR)介导的同源重组效率,Chir99021高剂量时可显著提高单链退火修复(single strand annealing,SSA)介导的同源重组效率; RS-1和PD173074低剂量时可显著提高HR效率(P <0. 05),但RS-1在高浓度时显著下调SSA修复效率(P <0. 05),而PD173074对SSA效率无显著影响(P>0. 05);此外单链寡核苷酸介导的DNA修复(single-stranded oligonucleotide,ss ODN)效率并不受小分子化合物处理的影响(P>0. 05)。本研究结果表明,适当浓度小分子化合物的应用有利于不同策略的基因敲入细胞系的产生,为获得精确的遗传修饰的动物模型打基础。

p53基因及NHEJ相关基因表达水平对基因组编辑效率的影响

目的研究CRISPR/Cas9基因组编辑系统在不同细胞中编辑效率的差异及相关的影响因素。方法基于靶向人TCRα链C区(TRAC)基因的CRISPR/Cas9重组载体分别对293T、HEK-293、HeLa、sw480、Jurkat、K562等细胞进行基因组编辑,检测编辑效率的差异。同时检测p53基因在不同细胞中的突变情况,通过RT-qPCR分析参与非同源末端连接(NHEJ)通路的17个主要基因的表达情况。结果流式检测各细胞的转染效率:293T为30.50%,HEK-293为29.30%,Hela为17.70%,SW480为21.90%,Jurkat为13.08%,K562为18.51%。根据克隆测序结果计算出各种细胞中基因组的编辑率:293T为74.70%、HEK-293为68.00%、Hela为13.47%、sw480为32.70%、Jurkat为65.52%、K562为77.18%。测序结果表明293T、Jurkat、K562细胞的p53基因发生了突变,而HEK-293、Hela和SW480的p53基因为野生型。qPCR结果显示,在编辑效率较高的细胞系中,大部分NHEJ相关基因的表达水平也较高,且其表达水平在p53功能异常细胞系中要比在p53功能正常细胞系中的高。结论本研究发现p53的异常程度以及NHEJ相关基因的表达水平与基因组编辑效率存在相关性。

重复元件介导的重组是新嵌合基因形成的一个重要机制

先前的研究提示重复元件在产生新的嵌合基因中具有机制性的作用,这与经典的外显子洗牌模型是一致的,它依赖于非同源重组。而近期一些关于染色体异常的研究结果显示,异位的同源重组可能对于产生新基因也非常重要。本项研究通过对8种果蝇的年轻基因进行筛选和分析,从中识别出了17个重复片段,它们是在最近1200万年中通过异位重组形成的。它们中的大多数已具有功能,并进化出多样的表达类型和嵌合结构。这些结果证实,重复元件介导的非等位同源重组在产生新嵌合基因中起到重要作用。

马尔尼菲青霉基于pkuB基因缺失的高效基因打靶系统构建

马尔尼菲青霉是温度依赖双相性条件性致病真菌,可感染免疫缺陷人群,区域流行于东南亚和我国南方。马尔尼菲青霉已成为研究真菌双相形态转换和病原-宿主相互作用分子机制的模式系统。功能基因组学研究为深入探讨马尔尼菲青霉双相转换和致病分子机制提供了线索,大量的候选基因功能需要高通量的基因修饰方法验证。在许多真菌中已建立基于阻断DNA非同源重组修复途径提高基因打靶效率的实验研究模型。本文报道在马尔尼菲青霉中通过缺失马尔尼菲青霉非同源重组修复途径的关键组分PKUB同源基因pkuB构建了一个高效基因打靶系统。结果表明,以pkuB基因缺失菌株(△pkuB)为出发菌株能降低外源DNA片段的非同源末端连接重组的概率而显著提高基因打靶效率,pkuB基因缺失不影响菌落形态和双相转换能力。高效基因打靶分子遗传实验模型的建立为大规模进行马尔尼菲青霉基因功能研究提供了有力的工具。

Ku蛋白在肿瘤DNA损伤修复中作用

Ku蛋白是由Ku70和Ku80 2个亚基组成的异源二聚体结构,因对DNA末端的识别保护作用、对整个非同源末端修复复合体的成核作用而成为非同源末端修复途径有效性的主要决定因素,决定了细胞的损伤修复能力。基因组的稳态依赖于有效DNA修复机制,未被有效修复的DNA损伤是基因突变和肿瘤形成的重要机制。目前,有关Ku蛋白在肿瘤发生、发展中的作用存在多种观点。本文就Ku蛋白的特点及其在肿瘤DNA损伤修复中作用的研究进展作一综述。

一例8P倒位重复伴末端缺失综合征的细胞和分子遗传学研究

目的 明确1例智力低下患儿8号染色体短臂异常的片段来源和位置,探讨该异常核型的发生机制、临床表型特征和家庭再发风险.方法 高分辨显带分析患者及其父母外周血染色体核型,比较基因组杂交芯片（array comparative genomic hybridization,array CGH）精细定位拷贝数异常改变的染色体片段区域,荧光定量PCR验证芯片分析结果.结果 患儿异常染色体为8p11.2-p23.1倒位重复和8p23.2-pter缺失;在重复和缺失之间间隔有1个长为5.70 Mb的拷贝数正常片段,嗅觉受体（olfactory receptor,OR）基因簇位于该片段的两端.结论 这是1例典型的inv dup del（8p）综合征,临床上以重度智力低下、大脑发育不良和特殊面容为主要特征,由8p23.1上OR基因簇的重复序列发生非等位同源重组所致.再生育时,不仅要预防inv dup del（8p）的再发风险,还要注意由同一重组机制造成的另外3种不良结局的妊娠风险.就目前所知,这是国内第1例明确诊断的inv dup del（8p）综合征.

拷贝数变异及其在眼病分子遗传学研究中的应用

拷贝数变异（CNV）是人类基因组内大于1kb的DNA片段拷贝数的异常变化，它广泛存在于正常个体，可能是人类表型变异的重要原因之一，是研究包括眼病在内的人类疾病的热点。目前认为CNV的形成机制可能是非等位基因同源性重组和非同源末端连接等所致。本文对CNV的多态性与表型变异、形成机制、检测方法及其在青光眼、白内障、虹膜发育不良、葡萄膜黑色素瘤、X-连锁眼白化病等眼病分子遗传学中的应用进行综述。

沉默NHEJ修复通路中关键蛋白Ku70在牙髓干细胞增殖和凋亡中的作用及其机制研究

目的:研究沉默非同源重组修复(non-homologous endjoining,NHEJ)通路中关键蛋白Ku70在牙髓干细胞增殖和凋亡中的作用,分析其机制。方法:提取健康恒牙牙髓组织,进行牙髓干细胞培养。采用脂多糖诱导人牙髓干细胞,分为对照组、阴性对照组、脂多糖组、沉默组和沉默+脂多糖组。观察Ku70免疫组化情况,进行细胞增殖、细胞凋亡实验,检测γ-H2A.X、Ku70、X线修复交叉互补基因4(X-ray repair cross complementary gene 4,Xrcc4)、Rad51 m RNA、Cleaved Caspase-3、p-p38水平。结果:与沉默组相比,对照组、阴性对照组、脂多糖组、沉默+脂多糖组各时间段牙髓干细胞增殖降低;沉默+脂多糖牙髓干细胞增殖高于脂多糖组(P<0.05)。随时间延长,脂多糖组牙髓干细胞增殖不断降低,其他四组牙髓干细胞增殖不断升高,其中在第5 d变化最明显。第5d,与沉默组相比,对照组、阴性对照组牙髓干细胞凋亡率、γ-H2A.X、Rad51 m RNA,Cleaved Caspase-3降低,p-p38升高;脂多糖组、沉默+脂多糖组各项指标较高,p-p38降低;对照组、阴性对照组、脂多糖组、沉默+脂多糖组Ku70、Xrcc4 m RNA降低(P<0.05)。沉默+脂多糖组牙髓干细胞凋亡率、γ-H2A.X、Rad51 m RNA,Cleaved Caspase-3低于脂多糖组,p-p38高于脂多糖组(P<0.05)。结论:沉默Ku70能促进脂多糖诱导的牙髓干细胞增殖,抑制其凋亡,其可能与γ-H2A.X、Rad51 m RNA表达降低,Ku70,Xrcc4升高有关。