基于FGFR非对称二聚化模型的FGF19改构体的设计及活性评估

目的:探究以成纤维细胞生长因子受体(FGFR)非对称二聚化模型为结构基础设计成纤维细胞生长因子19(FGF19)的非促肿瘤型改构体,并对其增殖活性和代谢活性进行评估,使其成为治疗胆汁淤积症的候选药物之一。方法:利用pymol软件分析蛋白晶体结构并设计FGF19改构体,将构建好的FGF19改构体(FGF19^(F159A))与FGF19野生型(FGF19^(WT))的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中,经过诱导表达、变性、复性获得正确构象的蛋白,经过镍柱亲和层析与分子排阻色谱方法纯化得到目的蛋白;通过蛋白邻位连接技术(PLA)对比FGF19^(WT)和FGF19^(F159A)诱导受体二聚化的程度;MTT实验检测细胞增殖活性;Western blot实验检测磷酸化成纤维细胞生长因子受体底物2(P-FRS2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(P-ERK)、胆固醇7α-羟化酶(Cyp7A1)的蛋白表达水平;免疫组化法检测动物肝脏中促增殖指标Ki67和增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达水平;RT-qPCR法检测动物肝脏中肿瘤指标甲胎蛋白(AFP)、细胞周期蛋白A2(CCNA2)、表皮生长因子受体(EGFR)的相对mRNA水平;质谱法测定肝脏中胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)的含量;以db/db小鼠为模型,连续给药1个月,监测药物的慢性降糖效果,糖耐量实验检测其对糖耐量的改善能力。结果:以蛋白结构为基础成功构建了FGF19^(F159A),经过表达纯化得到了高纯度的目的蛋白;PLA结果显示,与FGF19^(WT)组相比,FGF19^(F159A)诱导受体二聚化的能力明显减弱(P<0.01);MTT实验显示,与FGF19^(WT)组相比,FGF19^(F159A)的促增殖活性明显减弱(P<0.05);Western blot实验表明,与FGF19^(WT)组相比,FGF19^(F159A)明显下调P-FRS2和P-ERK的蛋白表达水平(P<0.05);免疫组化结果显示,与FGF19^(WT)组相比,FGF19^(F159A)组Ki67和PCNA的蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与FGF19^(WT)组相比,FGF19^(F159A)组AFP、CCNA2、EGFR的mRNA水平明显降低(P<0.01);与FGF19^(WT)组相比,FGF19^(F159A)组肝脏中Cyp7A1的蛋白表达水平,胆汁酸CA、DCA、UDCA、CDCA的含量差异无统计学意义(P>0.05);与FGF19^(WT)组相比,FGF19^(F159A)组的降糖能力和改善糖耐量的能力差异无统计学意义(P>0.05)。结论:基于FGFR非对称二聚化模型设计的FGF19改构体FGF19^(F159A)能够在极大减弱细胞增殖活性的同时保留其代谢活性,有望成为治疗胆汁淤积症的候选药物。