干扰RNA的非靶免疫副作用及其siRNA序列设计与化学修饰

siRNA介导的RNA干扰技术已经成为基因功能研究和开展疾病治疗的有用工具.近年发现,siRNA在哺乳动物体内可激活天然免疫系统,诱导干扰素等炎症因子的分泌,并且可非特异性抑制某些非靶基因的表达,有可能极大限制RNA干扰技术的应用.进行高效特异性siRNA的设计和修饰,以保持或者增强siRNA的特异性靶基因沉默作用,又消除siRNA对机体的非靶免疫副作用,成为使siRNA安全有效应用于临床治疗的关键.

RNA干扰沉默IGF-Ⅰ R表达对非小细胞肺癌细胞生物学特性及化疗敏感性的影响

目的:评价RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,对人肺癌A549细胞系中胰岛素样生长因子类受体(IGF-Ⅰ R)表达的阻断效应,和IGF-Ⅰ R基因沉默后细胞增殖、凋亡等生物学特性及肿瘤细胞对化疗药物敏感性的改变。方法:应用U6启动子,介导DNA模板转录生成短发夹样RNA(shRNA),并转染人肺癌A549细胞株,从而产生IGF-Ⅰ R特异性小干扰RNA(siRNA),经RT-PCR和Western blot检测IGF-Ⅰ R表达的改变;联合应用化疗药物顺铂(DDP),通过MTT法和流式细胞技术等,观察细胞生长、细胞周期、细胞凋亡及DDP半数致死量(IC50)的变化。结果:IGF-Ⅰ R表达水平明显下降(抑制率高达89.8%),肿瘤细胞增殖能力明显减弱,细胞滞留于G0期的比例上升;DDP对肿瘤细胞24h、48h、72h的IC50均明显减少,IGF-Ⅰ R siRNA1组DDP作用72h的IC50为0.92 mg/L,明显低于control-siRNA组的3.77mg/L,0.5mg/L DDP联合IGF-Ⅰ R siRNA1作用48h后,A549细胞的生长抑制率达32.1%,明显高于control-siRNA组的18.9%,细胞凋亡率从27.8%上升至44.2%。结论:运用RNAi技术能有效抑制A549细胞IGF-Ⅰ R的表达,使细胞增殖能力减弱,化疗敏感性增加。

非病毒靶向载体递送小干扰RNA的研究进展

近年来由小干扰RNA(siRNA)所介导的RNA干扰(RNAi)技术发展迅速,如何高效、安全地将siRNA转运至靶组织是决定这一技术应用前景的关键问题。本文重点围绕构建siRNA的非病毒靶向载体递送系统的研究进展进行综述。

RNA干扰INK4位点反义非编码RNA抑制人肺癌细胞系生长的分子机制

目的探讨INK4位点反义非编码RNA(ANRIL)下调对CDKN2B-CDKN2A-ARF基因簇的调控及对人肺癌细胞生长的影响。方法通过RNA干扰下调人肺鳞状细胞癌细胞系H520中ANRIL的表达,实时荧光定量聚合酶链反应检测RNA干扰前后细胞中ANRIL mRNA的表达变化,绘制细胞生长曲线;实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测RNA干扰前后细胞中细胞同期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)、CDKN2A、ARF mRNA和蛋白的表达变化。结果 RNA干扰可显著下调ANRIL mRNA的表达(P<0.05),ANRIL下调能抑制人肺鳞状细胞癌细胞系H520的生长(P<0.05),引起CDKN2B、CDKN2A、ARF mRNA和蛋白的表达升高(P<0.05)。结论 RNA干扰AN-RIL能抑制人肺鳞状细胞癌细胞的生长,ANRIL可能通过调控CDKN2B-CDKN2A-ARF基因簇起作用。

RNA干扰沉默NS基因对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究RNA干扰沉默核干细胞因子(nucleostemin,NS)基因表达对人肺腺癌A549细胞株增殖和凋亡的影响。方法:向A549细胞内分别转染靶向NS基因的siRNA表达载体pcDNA4/C-NS-silencer和空载体pcDNA4/C vector作为silencer组和vector组,以不转染质粒的A549细胞为normal组,Real-time PCR检测转染pcDNA4/C-NS-silencer对A549细胞内NS基因表达的影响。CCK-8法检测沉默NS基因对A549细胞增殖的影响,流式细胞术检测对细胞周期的影响,Hoechst33258核染色法和流式细胞术检测对细胞凋亡的影响。结果:Silencer组NS基因表达较vector组和normal组明显被抑制(0.166±0.024 vs 0.497±0.022、0.505±0.032,均P<0.01);Silencer组A549细胞增殖活性显著低于vector组和normal组(0.518±0.107 vs 0.855±0.102、0.832±0.158,均P<0.05);Silencer组A549细胞周期阻滞于G0/G1期;Silencer组细胞核皱缩呈致密浓染,染色质碎裂呈块状并有边集现象,且细胞凋亡率较vector组与normal组显著增高[(34.80±6.77)%vs(9.70±1.50)%,(8.16±2.01)%,P<0.01]。结论:RNA干扰沉默NS基因可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖,促进细胞凋亡。

RNA干扰抑制CD59对非小细胞肺癌GLC-P细胞株增殖的影响

目的运用RNAi技术抑制CD59基因的表达,观察其对非小细胞肺癌细胞株GLC-P增值、凋亡的影响。方法合成可抑制CD59基因的片段,并运用RNA干扰技术,构建重组质粒,通过脂质体转染法将重组质粒转染至非小细胞肺癌细胞株GLC-P,并筛选出稳定表达细胞后,采用PCR、MTT、ELISA法检测该稳定表达细胞株的增值、凋亡所受到的影响。结果干扰后的GLC-P细胞株中CD59 m RNA表达量较未干扰组显著降低(P<0.05),同时MTT、ELISA实验检测显示肺癌GLC-P细胞增殖能力降低,可诱导肺癌细胞的凋亡。结论肺癌患者肿瘤细胞中存在CD59高表达,抑制CD59基因表达的同时可抑制GLC-P细胞的增殖能力并诱导细胞凋亡,为非小细胞肺癌的靶向治疗提供了新靶点、新思路。

RNA干扰抑制ERCC1对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响

目的探讨利用RNA干扰技术沉默切除修复交叉互补基因组1(ERCC1)表达对非小细胞肺癌耐药细胞株顺铂化疗敏感性的影响。方法设计并合成3段靶向人的ERCC1基因的小分子干扰RNA(siRNA),构建携带ERCC1-shRNA的重组质粒表达载体,采用脂质体Lipofectamine 2000转染入人肺癌细胞株A549/DDP,荧光镜下观察并测定转染效率;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后ERCC1mRNA的表达情况;应用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测干扰ERCC1后A549/DDP细胞对顺铂敏感性的变化。结果转染针对ERCC1的siRNA后,转染组A549/DDP细胞内ERCC1mRNA表达均下降,转染后肺癌A549/DDP细胞对顺铂敏感性增加。结论利用RNA干扰技术能够筛选出高效的特异阻断ERCC1基因表达的siRNA;ERCC1基因表达下调能够增加肺癌A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,部分逆转耐药。

长链非编码RNA AK005183干扰载体构建及慢病毒包装

为研究长链非编码RNA AK005183在精子发生中的功能,设计、合成了干扰AK005183表达的shRNA序列,并构建其干扰表达重组慢病毒载体CD513B-U6-AK005183,将干扰表达质粒及对照质粒分别转染NIH3T3细胞系,实时定量PCR检测CD513B-U6-AK005183质粒对AK005183的表达具有较好的干扰效果。利用第三代慢病毒包装系统,将CD513B-U6-AK005183、pGag-Pol、pRsv-rev、pVSV-G质粒共转染293T细胞系,包装得到滴度为5×106 TU/mL的干扰表达重组慢病毒。用CD513B-U6-AK005183慢病毒转导GC-1spg细胞系,检测到AK005183的表达下调64%。表明本研究成功构建并包装得到高效干扰长链非编码RNA AK005183表达的重组慢病毒,将为深入研究长链非编码RNA在精子发生过程中的功能奠定了基础。

APFSDS脱壳非对称性研究

本文根据已建立的非对称脱壳动力学模型,分析了各种干扰因素的影响规律,给出了各种干扰因素的估算方法,并根据一具体的脱壳弹脱壳过程的实验研究和数值模拟,研究了弹托脱壳非对称性的根源、发展规律及其对射击密集度的影响,其结果是满意的.

RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅡA(MYH9)表达的研究

目的:构建人MYH9(非肌肉肌球蛋白重链ⅡA)的siRNA表达体系,抑制原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)MYH9基因的表达。方法:针对人MYH9基因序列,构建siRNA表达质粒,通过酶切和测序鉴定确定其序列正确性。分别转染重组质粒pGCsi-MYH9-1/2/3至HUVEC细胞,通过半定量RT-PCR和蛋白质印迹,分别检测在转染后24h、48h、72h MYH9在mRNA转录水平及蛋白表达的变化。结果:在构建的3种重组质粒中,pGCsi-MYH9-2、pGCsi-MYH9-3在转染后24h均表现出一定的干扰作用,转染后48h干扰作用最强,转染后72h干扰作用减弱;pGCsi-MYH9-3的干扰作用最明显,转染后48h,能明显下调HUVEC的MYH9蛋白表达,抑制率平均可达71.2%,此时MYH9基因mRNA转录明显减少,抑制率为86.5%。结论:在转染后48h pGCsi-MYH9-3可明显抑制HUVEC细胞内源MYH9的表达,为进一步研究MYH9在相关疾病中的功能奠定基础。

靶向EGFR的RNA干扰诱导非小细胞肺癌细胞A549凋亡的研究

目的:探讨短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的靶向EGFR基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞A549的凋亡诱导作用。方法:构建靶向人EGFR基因的表达shRNA的质粒(pShEGFR),转染A549细胞,应用RT-PCR分析EGFR mRNA的表达情况,采用MTT法检测A549细胞的生长状况,通过流式细胞仪以及PI染色法进行细胞凋亡的定量检测和形态学分析。结果:pShEGFR转染组A549细胞中EGFR mRNA的表达水平,较转染同一载体连接无关序列的对照组(pShNEG组)、单纯脂质体组及PBS阴性对照组A549细胞均明显降低,F=425.640,P=0.000,其中较PBS阴性对照组细胞降低了74.5%。转染pShEGFR的A549细胞与3种不同对照组细胞相比,生长受到明显抑制,F=107.428,P=0.000,生长抑制率达54.9%,而转染pShNEG组和单纯脂质体组的A549细胞生长抑制率则分别为20%和3.1%。流式细胞仪检测结果显示,pShEGFR组细胞存在32.8%的凋亡率,PI荧光染色可见pShEGFR组细胞呈现出典型的凋亡形态学变化。结论:质粒介导的靶向人EGFR基因的pShEGFR能够有效地干扰NSCLC细胞系A549中EGFR基因的表达,进而抑制肿瘤细胞的生长,诱导肿瘤细胞的凋亡。

长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1参与盆腔器官脱垂的机制

背景:作者所在课题组前期通过高通量测序结果发现长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1在盆腔器官脱垂患者子宫主韧带中表达明显降低,转化生长因子β1信号通路也是相关通路之一。目的:观察长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1对盆底韧带成纤维细胞的影响,探讨其在盆腔器官脱垂疾病发病机制中的可能作用。方法:提取大鼠盆底韧带组织标本,分离成纤维细胞,进行原代培养。慢病毒构建长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1干扰和过表达载体加入成纤维细胞中。通过免疫荧光、MTT、细胞划痕实验、流式细胞术来检测成纤维细胞的形态、增殖、迁移和凋亡情况;RT-PCR和Western-blot检测转化生长因子β1、smad2/3、c-Myc的mRNA及蛋白表达情况。结果与结论:①长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1过表达时可显著促进成纤维细胞的增殖,提高细胞的迁移能力,抑制成纤维细胞凋亡;长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1干扰时结果相反;②此外,长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1过表达时细胞中的c-Myc、转化生长因子β1、smad2/3的mRNA和蛋白相对表达量均明显增加,其干扰时则显著抑制c-Myc和转化生长因子β1的表达;③提示长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1能够影响成纤维细胞的形态和生物学功能,可能与转化生长因子β1/smad2/3/c-Myc通路有关;该研究可为盆腔器官脱垂患者的临床诊断和治疗提供新思路。

小干扰RNA靶向5'非编码区抗肠道病毒71型感染的研究

目的筛选靶向肠道病毒71型(EV71)基因组保守的5’非编码区(UTR)的有效小干扰RNA(siRNAs),确定有效靶点序列。方法设计合成靶向EV71基因组5’UTR的siRNAs;细胞毒性实验检测siRNAs对RD细胞的生存和生长的影响,显微镜观察siRNAs对EV71致细胞病变效应的影响,细胞生存实验、TaqMan实时定量RT-PCR实验筛选有效siRNAs。结果 siRNAs未影响RD细胞的生存及生长,对培养细胞无明显毒性。靶向EV71基因组5’UTR的si-1和si-2抗病毒效能最显著,能够延缓及减轻EV71感染致细胞病变效应,明显提高感染细胞的生存率,降低感染细胞中EV71 RNA的转录水平,且这种作用具有序列特异性。结论筛选出的靶向EV71基因组保守5’UTR的2个有效siRNA(ssi-1和si-2),对多株EV71中国流行株可能具有广谱抗病毒效能。

利用小干扰RNA沉默长非编码RNA ZFAS1能够促进安罗替尼对非小细胞肺癌的抗肿瘤活性

目的:利用小干扰RNA(si RNA)下调长非编码RNA(lnc RNAs)ZFAS1,探索靶向ZPAS1的安罗替尼(anlotinib)增敏治疗策略。方法:在非小细胞肺癌细胞A549中转染对照si RNA或ZFAS1的小干扰RNA(si ZFAS1)后,将细胞注射入裸鼠皮下形成裸鼠皮下肿瘤,对动物口服灌胃给予安罗替尼,确定下调ZFAS1的小干扰RNA对安罗替尼抑制A549细胞皮下肿瘤的影响。进一步将A549细胞通过肝门静脉注射进入裸鼠肝脏,确定下调ZFAS1的小干扰RNA对安罗替尼抑制A549细胞在裸鼠肝脏原位形成肿瘤的影响。收集细胞样品,检测si ZFAS1对N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白及波形蛋白等NOTCH下游上皮-间质转化相关指示分子表达的影响。结果:在A549细胞中转染ZFAS-1的小干扰RNA能够抑制A549细胞的上皮间质转化作用,促进高安罗替尼对A549细胞的杀伤作用。结论:ZFAS1是非小细胞肺癌分子靶向治疗的潜在干预靶标,利用小干扰RNA能够促进安罗替尼对A549细胞的杀伤作用。

基于RNA干扰的非病毒递送载体研究进展

干扰RNA和微小RNA均由约20个碱基对组成,具有调控基因表达的功能,已广泛应用于肿瘤、心血管、组织再生等疾病的诊断、治疗中。利用可逆性的RNA干扰技术调控体内基因的表达以实现对疾病的治疗已受到越来越多的研究者的关注。但干扰RNA和微小RNA本身存在如带负电荷、易降解、细胞摄取低、核酸酶降解及内涵体释放困难等问题,因此,一种高效低毒的基因递送系统对于提高基于RNA干扰的治疗效果具有重要的作用。随着对纳米递送系统的开发,出现各种各样的基因递送系统,本文主要对非病毒递送系统在递送干扰RNA和微小RNA上作用进行综述,分析递送系统的设计思路、方法和作用机制,为未来设计递送RNA干扰核酸的非病毒载体提供一定的指导。

一个长链非编码RNA通过干扰素诱导蛋白6调节HCV感染

【据《Hepatology》2019年3月报道】题:一个长链非编码RNA通过干扰素诱导蛋白6调控HCV的感染(作者LIU X等)长链非编码RNA(lncRNA)在很多细胞生理过程中起着至关重要的调节作用。然而,lncRNA调控病毒感染及宿主免疫应答的机制尚不完全清楚。中国西南大学刘骁等做了一项研究旨在探讨lncRNA在HCV感染和IFN应答中的调节作用。

小分子干扰RNA非病毒纳米载体的设计进展

小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)进入临床应用最关键的环节是如何有效通过药物递送系统将siRNA递送到特异性靶细胞或靶组织。非病毒纳米载体递送系统具有低的免疫原性、良好的靶向性和生物相容性,是近年来国内外药剂工作者研究的热点。其相应的研究也必将大大增加siRNA有效递送,使其有进一步成为治疗药物的可能性。本文根据国内外的文献报道,将siRNA非病毒纳米载体的设计进展进行了综述。

lncRNA NEAT1在鼻咽癌中的表达情况及其对鼻咽癌放疗敏感性的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)核旁斑富集转录本1(NEAT1)在鼻咽癌中的表达情况及其对鼻咽癌放疗敏感性的影响。方法(1)使用UALCAN数据库分析NEAT1在头颈部鳞状细胞癌中的表达情况及其与患者临床分期、预后的关系。(2)利用实时荧光定量PCR检测鼻咽癌组织及正常鼻咽黏膜上皮、人永生化鼻咽上皮细胞NP-69及多株鼻咽癌细胞(CNE-1、CNE-2、CNE-2R、C666-1、C666-1R)中NEAT1的表达情况。(3)使用RNA干扰技术构建NEAT1沉默的CNE-2R细胞[NEAT1-短发夹RNA(shRNA)组],并设立对照组(未转染的CNE-2R细胞)、NEAT1-NC组(转染对照序列的CNE-2R细胞)。给予不同放射剂量X线照射后,检测3组CNE-2R细胞的存活率、凋亡率、克隆形成率及放射生物学参数。结果(1)NEAT1在头颈部鳞状细胞癌组织中呈高表达,且表达水平随着头颈部鳞状细胞癌分期的增加呈升高趋势(P<0.05),但不同NEAT1表达水平患者的总生存率差异无统计学意义(P>0.05)。(2)相较于正常鼻咽黏膜上皮组织,鼻咽癌组织中NEAT1表达上调(P<0.05)。相较于NP-69细胞,NEAT1在鼻咽癌细胞中的表达上调(P<0.05),其中CNE-2R细胞中的表达量最高(P<0.05);放射抗拒性细胞CNE-2R、C666-1R中NEAT1的表达量分别高于放疗敏感性细胞CNE-2、C666-1(P<0.05)。(3)在接受不同剂量X射线照射后,与对照组及NEAT1-NC组比较,NEAT1-shRNA组CNE-2R细胞存活率、克隆形成率及放射生物学参数降低,凋亡率升高(P<0.05),但对照组与NEAT1-NC组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论lncRNA NEAT1在鼻咽癌组织和细胞中呈高表达,与肿瘤分期密切相关,沉默NEAT1的表达可增加鼻咽癌的放疗敏感性。

曹雪涛院士团队研究成果揭示非编码RNA调节干扰素产生

2019年6月18日,曹雪涛院士团队在《细胞研究》( Cell Research )在线发表题为“Interferon-inducible cytoplasmic lncLrrc55-AS promotes antiviral innate responses by strengthening IRF3 phosphorylation”的研究论文(https://doi.org/10.1038/s41422-019-0193-0)。该研究鉴定了一种新的细胞质长链非编码RNA(lncRNA)—— lncLrrc55-AS ,可以驱动正反馈环以促进干扰素调节因子3(IRF3)信号传导和Ⅰ型干扰素产生。

shRNA干扰对肺癌细胞内Skp2和p27水平及其生长的影响

目的:探讨干扰肺腺癌SPC-A-1细胞中Skp2(S-phase kinase associated protein,Skp 2)基因的发夹结构RNA(smallhairpin RNA,shRNA)对肺癌细胞Skp2和p27基因表达的影响及对细胞生长的影响。方法:设计、合成特异性的shRNA序列并与pGenesil-1质粒载体连接转染SPC-A-1细胞,经过稳定筛选后的肺癌细胞,通过RT-PCR和Western印迹法分别检测细胞内Skp2、p27 mRNA和蛋白的表达情况,MTT法检测细胞生长情况并绘制生长曲线。结果:在转染干扰RNA后SPC-A-1细胞内的Skp2 mRNA及蛋白表达下降明显,而p27蛋白水平却明显上升,这与抑制了Skp2表达导致p27降解减少有关。生长曲线表明细胞生长受到了抑制。结论:成功构建了针对Skp2基因的shRNA真核表达载体,能有效抑制肺癌细胞生长,并使得Skp2基因表达下降,p27基因的表达增多,为肺癌细胞的基因治疗提供了实验依据。