TP63对非小细胞肺癌细胞吉非替尼耐药性及DSC3/DSG3基因表达的影响

目的探讨肿瘤蛋白(TP)63对非小细胞肺癌细胞吉非替尼耐药性及桥粒芯胶蛋白(DSC)3/桥粒芯糖蛋白(DSG)3的影响。方法体外培养人非小细胞肺癌吉非替尼敏感细胞株PC9、吉非替尼耐药细胞株PC9/GR,将PC9/GR细胞随机分为对照组、TP63-siRNA组(转染TP63-siRNA)和NC-siRNA组(转染NC-siRNA),用细胞计数试剂盒(CCK)-8法检测转染后细胞吉非替尼半数抑制浓度(IC50)和细胞增殖情况;流式细胞术检测PC9/GR细胞凋亡情况;划痕实验检测细胞迁移;Transwell小室法检测细胞侵袭;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组细胞TP63、DSG3、DSC3 mRNA表达;蛋白印迹分析法检测各组细胞TP63、DSG3、DSC3蛋白表达。结果与PC9细胞相比,耐药细胞PC9/GR中TP63 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与对照组和NC-siRNA组相比,TP63-siRNA组PC9/GR细胞IC50值,细胞增殖、迁移、侵袭能力,TP63、DSG3、DSC3 mRNA及蛋白表达显著下降,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。结论TP63在PC9/GR细胞中高表达,干扰TP63表达可抑制DSC3/DSG3表达,逆转PC9/GR对吉非替尼耐药性。

乳酸对人非小细胞肺癌细胞A549生物学特性影响的研究

背景肿瘤的重要特征之一是代谢异常,乳酸作为代谢产物也参与肿瘤代谢。目的探讨乳酸对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞A549糖酵解压力、增殖、迁移和周期等生物学特性的影响。方法培养人非小细胞肺癌细胞A549,分为对照组、5 mmol/L乳酸处理组和10 mmol/L乳酸处理组。对照组不作任何处理,其他两组乳酸处理24 h后,通过Seahorse细胞代谢分析仪分析乳酸处理后A549细胞的糖酵解压力和线粒体底物选择,qPCR检测糖酵解相关基因(HK3、LDHA、LDHB、PKM)和细胞周期及迁移相关基因(CCNE1、CCND1、CCNB1、CDK2、CDH1、TWIST1、SNAI2)mRNA表达水平,Western blot检测糖酵解相关蛋白(G6PD、PKM2、HK1和LDHA)水平。利用实时无标记细胞分析(real time cellular analysis,RTCA)、流式细胞术分析乳酸对NSCLC细胞A549增殖、迁移、周期等生物学特性的影响。结果两个乳酸处理组相较对照组糖酵解降低,糖酵解最大能力及糖酵解储备均降低且10 mmol/L乳酸处理组比5 mmol/L组降低更显著(P<0.05),糖酵解关键酶在mRNA和蛋白水平下调。10 mmol/L乳酸处理组与对照组相比,对脂肪酸的依赖性增强,对谷氨酰胺的氧化能力减弱(P<0.05);RTCA结果显示两个乳酸处理组相较对照组细胞迁移降低,增殖能力降低,10 mmol/L乳酸处理组较5 mmol/L组增殖和迁移能力下降更为显著(P<0.05)。两个乳酸处理组CCNE1、CCND1、CCNB1、TWIST1基因m RNA水平下调,CDK2、CDH1基因mRNA水平上调。流式结果显示10 mmol/L乳酸处理组G0/G1期细胞增多(P<0.01),S期细胞数量降低(P<0.05),G2/M期细胞数量降低(P<0.05)。结论加入外源乳酸处理后,A549细胞糖酵解能力降低,且与乳酸浓度呈负相关,细胞氧化底物变化,随着乳酸浓度的增加其细胞增殖及迁移能力显著降低,通过细胞周期结果分析后推测加入外源乳酸可能使A549细胞抑制在G1期。

乳酸上调非小细胞肺癌细胞中总胆固醇水平的机制研究

背景胆固醇与非小细胞肺癌发生相关并增强非小细胞肺癌细胞耐药性,研究显示乳酸能通过降低pH使SREBP2活化进而上调细胞内胆固醇水平。目的探索乳酸调节非小细胞肺癌细胞内总胆固醇水平的其他分子机制。方法分析TCGA数据库中非小细胞肺癌乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)与胆固醇合成代谢酶基因表达水平的相关性。将人肺支气管上皮细胞BEAS-2B和人非小细胞肺癌细胞H1299分为对照组(正常培养)和乳酸处理组(在培养基中添加乳酸),将人非小细胞肺癌细胞A549分为对照组(正常培养)、乳酸处理组(在培养基中添加乳酸)和盐酸处理组(在培养基中添加盐酸)。利用总胆固醇测定试剂盒测定细胞内总胆固醇水平,qPCR测定细胞内胆固醇合成代谢酶基因的mRNA水平。利用染色质免疫共沉淀分析对照组和乳酸处理组A549细胞中胆固醇合成代谢酶基因启动子区组蛋白乳酸化水平。结果Wilcoxon秩和检验分析TCGA数据结果显示,LDHA高表达的非小细胞肺癌细胞中胆固醇合成代谢酶基因HMGCR、ACAT1、ACAT2、SQLE和FDFT1表达水平升高(P<0.05)。独立样本t检验分析对照组和乳酸处理组细胞内总胆固醇水平及胆固醇合成代谢酶基因的mRNA水平,结果显示,与对照组细胞相比,乳酸处理组BEAS-2B、A549和H1299细胞内总胆固醇水平升高(P<0.01),且乳酸处理组BEAS-2B和A549细胞中HMGCR、FDPS、GGPS1和SQLE基因mRNA水平也升高(P<0.01)。与对照组相比,乳酸和盐酸处理组A549细胞内总胆固醇水平均升高(P<0.05),且HMGCR和FDFT1基因mRNA水平也升高(P<0.01),但盐酸的作用显著弱于乳酸(P<0.01)。染色质免疫共沉淀结果显示,乳酸处理组A549细胞中HMGCR、SQLE和GGPS1基因启动子区组蛋白乳酸化水平有升高趋势;与对照组相比,乳酸处理组A549细胞内总胆固醇水平升高(P<0.01),而乳酸脱氢酶抑制剂草氨酸钠能逆转乳酸上调A549细胞内总胆固醇水平(P<0.01)。结论乳酸能上调非小细胞肺癌细胞内总胆固醇水平,该过程可能的分子机制为组蛋白乳酸化修饰促进胆固醇合成代谢酶基因表达,且乳酸通过转化为乙酰辅酶A参与胆固醇合成。

大豆苷元影响非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡:p53信号通路的作用

目的研究大豆苷元(daidzein,DD)对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响,并重点探讨p53信号通路在其中可能发挥的作用。方法CCK-8法和流式细胞术检测大豆异黄酮和DD对HELF和H1299细胞活力和凋亡的影响;基因芯片技术检测DD处理H1299细胞后基因的表达量变化,GSEA和差异分析筛选主要通路和关键基因;RT-qPCR和Western blot实验验证主要通路中关键基因(p53和CASP9)的mRNA和蛋白表达差异;p53抑制剂Pifithrin-α抑制p53的表达后,检测DD对p53 mRNA和蛋白表达水平的影响,并观察其对H1299细胞的增殖效应。结果大豆异黄酮和DD能促进肺正常细胞增殖和抑制其凋亡,且能抑制肺癌细胞增殖和促进其凋亡。p53信号通路在DD处理组中明显富集(NES=1.78,P=0.000),且发现处理组中p53和CASP9基因的表达出现明显上调。与对照组相比,DD处理的HELF和H1299细胞中CASP9和p53的mRNA表达均明显提高(P<0.05),HELF细胞中p53蛋白表达亦出现增加(P<0.05)。抑制p53表达后,DD可明显增加H1299和HELF细胞中p53的mRNA表达(P<0.05),亦可明显提高H1299细胞中p53蛋白的表达(P<0.05),并观察到DD可抑制肺癌细胞的增殖。结论DD能抑制肺癌H1299细胞的增殖并促进其凋亡,且其机制主要涉及p53信号通路。

苯烯莫德抑制非小细胞肺癌细胞A549的增值并诱导其凋亡

目的:探究苯烯莫德抑制非小细胞肺癌细胞A549的增殖并促进其凋亡的作用机制。方法:通过克隆形成实验检测苯烯莫德对非小细胞肺癌细胞A549和H1299增殖能力的影响,并用CCK‐8实验检测不同浓度苯烯莫德对非小细胞肺癌细胞A549细胞活力的影响;不同浓度的苯烯莫德(0,5,10,20)μmol/L处理A549细胞24 h,采用PI染色流式细胞仪检测苯烯莫德对A549细胞周期进程的影响,并采用Western Blot实验检测不同浓度苯烯莫德作用对周期相关蛋白P21和CDK2表达的影响;不同浓度的苯烯莫德(0,10,20,40)μmol/L处理A549细胞48 h,Annexin V‐FITC和PI双染检测苯烯莫德对A549细胞凋亡的影响,并采用Western Blot实验检测不同浓度苯烯莫德作用对凋亡相关蛋白cleaved‐caspase3,cleaved‐PARP表达的影响;通过Western Blot实验检测A549细胞在不同浓度(0,5,10,20)μmol/L苯烯莫德用下p‐AKT和FOXO1表达的变化。结果:克隆形成实验结果发现,40μmol/L的苯烯莫德会完全抑制A549和H1299细胞的增殖(P<0.01)。CCK‐8实验发现,与对照组(0μmol/L)相比,A549细胞活力随苯烯莫德作用浓度的增加而逐渐下降(P<0.01)。采用Annexin‐FITC/PI双染A549细胞后,流式细胞仪检测发现A549细胞凋亡率随苯烯莫德作用浓度的增加而增高(40μmol/L苯烯莫德作用后,P<0.01)。苯烯莫德作用A549细胞48 h后,与对照组(0μmol/L)组相比,cleaved‐caspase 3和cleaved‐PARP蛋白表达增加(P<0.01)。采用PI单染A549细胞后,流式细胞检测发现苯烯莫德诱导A549细胞阻滞在G1期。苯烯莫德作用A549细胞24 h,P21蛋白表达增加而CDK2表达下降(P<0.01)。不同浓度苯烯莫德作用A549细胞后,AKT磷酸化水平显著被抑制,而FOXO1表达水平增加。结论:苯烯莫德抑制A549细胞的增殖,并诱导凋亡,其作用机制可能与AKT/FOXO1信号通路有关。

不同非小细胞肺癌细胞株中DNA-PKcs的表达及其与放射敏感性的关系

背景与目的:DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)在电离辐射引起的DNA双链断裂的修复过程中起着关键作用,可影响组织细胞对放射治疗的敏感性。本研究通过检测DNA-PKcs在不同组织学类型非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞中的表达情况,探讨其与放射敏感性的关系。方法:Westernblot及DNA-PK活性分析法检测NSCLC细胞株A549、H1299、L78、PGCL3和H460中DNA-PKcs的含量与活性。成克隆实验分别测定各细胞株照射后的剂量-存活曲线,并分析放射敏感性与DNA-PKcs的关系。结果:成克隆实验结果显示:不同NSCLC细胞株的放射敏感性不同,A549细胞2Gy剂量照射下的存活分数(survival fractionat2Gy,SF2)为0.74,H1299细胞为0.25,H460细胞为0.21,PGCL3细胞为0.48,L78细胞为0.58。Westernblot显示各NSCLC细胞株中DNA-PKcs的表达有差异,A549细胞的DNA-PKcs表达水平为3.26±0.98,L78细胞为0.51±0.07,H1299细胞为0.51±0.11,H460细胞为0.86±0.23,PGCL3细胞为2.60±0.76。A549细胞的DNA-PKcs活性为8.30±1.03,H1299细胞为2.45±0.52,H460细胞为0.11±0.02,PGCL3细胞为4.13±0.87,L78细胞为0.42±0.07。在腺癌及大细胞癌中SF2与DNA-PKcs含量(P<0.05,r=0.95)及活性(P=0.03,r=0.98)呈线性相关。结论:在腺癌及大细胞癌中,DNA-PKcs是判断细胞放射敏感性的重要因素。

人非小细胞肺癌细胞膜钾离子通道特性的研究

目的 研究人非小细胞肺癌细胞膜钾离子通道特性。方法 采用原代培养的非小细胞肺癌细胞、肺部良性病变和癌旁支气管上皮细胞 ,应用膜片钳全细胞记录方式检测细胞膜钾离子通道特性。结果 ( 1)非小细胞肺癌细胞膜K+ 通道表达的K+ 电流具有电压依赖性 ,能被K+ 通道阻断剂TEA阻断。鳞癌细胞膜电流具有失活趋势和内向整流特点 ;腺癌细胞膜电流具有不失活特性 ,无内向整流特点。TP =5 0～ 90mV时 ,时间常数 (τ值 )为 3.6～ 9.8ms。非小细胞肺癌细胞膜电容为 ( 15 .35± 0 .65 )pF ,K+ 电流密度为 ( 12 1.0 8±8.35 )A/F。 ( 2 )非小细胞肺癌细胞膜K+ 电流幅度、电流密度和膜电容较支气管上皮细胞明显增高 (P <0 .0 0 1) ,癌细胞τ值显著小于支气管上皮细胞的τ值 (P <0 .0 0 1)。结论 ( 1)非小细胞肺癌细胞膜存在与延迟整流性类似的钾离子通道 ,且表达明显增加 ,活动明显增强。 ( 2 )检测肺癌细胞膜K+ 通道可为研究肺癌发生、发展。

布鲁生抑制非小细胞肺癌细胞环氧化酶2表达的研究

背景与目的:布鲁生是中药马钱子有效成分之一,具有镇痛、抗炎和抑制血小板聚集等多种药理活性。鉴于该药物的细胞毒性,研究表明其具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用。本研究旨在观察布鲁生对人非小细胞肺癌细胞A549增殖与凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:MTT法检测布鲁生对A549细胞存活的影响;流式细胞仪、荧光显微镜法研究布鲁生对A549细胞凋亡的影响;酶联吸附法检测布鲁生对A549细胞释放PGE2的影响;RT-PCR法检测布鲁生对A549细胞COX-2 mRNA的影响;Western印迹法检测布鲁生对环氧化酶COX-2蛋白表达的影响;荧光素酶报告基因法检测布鲁生对COX-2转录活性的影响。结果:布鲁生能明显抑制A549细胞增殖,并呈剂量依赖性诱导A549细胞凋亡;能抑制A549细胞中环氧化酶COX-2的表达与PGE2的释放。过度表达COX-2能抑制布鲁生诱导的细胞凋亡;COX-2 siRNA处理细胞后能明显增强布鲁生诱导的A549细胞凋亡作用。布鲁生能显著性抑制COX-2的转录激活。结论:COX-2是布鲁生诱导细胞凋亡重要的靶蛋白。

TIPE2抑制AP-1蛋白增加人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1975化疗敏感性的机制研究

目的:探讨TIPE2增强非小细胞肺癌细胞系NCl-H1975化疗敏感性及其机制。方法:非小细胞肺癌系NCIH1975转入TIPE2慢病毒载体后,加入CDDP后使用CCK-8测量IC50值,凋亡细胞用Annexin V/FITC和PI凋亡检测试剂盒进行检测,Western blot检测转染TIPE2后AP-1及MDR-1的蛋白表达量,实时荧光定量PCR检测转染TIPE2后IL-1、IL-6及TNF-αmRNA水平。结果:(1)TIPE2降低非小细胞肺癌系NCI-H1975细胞IC50值(P<0.001);(2)TIPE2增加非小细胞肺癌系NCI-H1975细胞对CDDP的凋亡率(P<0.05);(3)TIPE2可显著降低非小细胞肺癌系NCI-H1975细胞中AP-1及MDR1的表达量;(4)TIPE2可显著降低非小细胞肺癌系NCI-H1975细胞中IL-1、IL-6及TNF-αmRNA水平的表达(P<0.01)。结论:TIPE2可能通过抑制AP-1蛋白增加非小细胞肺癌细胞系NCl-H1975对CDDP的化疗敏感性。

β-榄香烯对非小细胞肺癌细胞迁移的影响及其机制研究

目的探究β-榄香烯对非小细胞肺癌细胞迁移的影响及其作用机制。方法将人非小细胞肺癌A549细胞分为5组:空白对照组、β-榄香烯低、中、高剂量组(10μg·mL;、25μg·mL;、50μg·mL;)、顺铂(Cisplatin,CDDP,20μmol/L)组。根据分组,分别用对应的药物处理细胞。Hoechst 33258染色观察细胞凋亡;Transwell小室检测细胞迁移;Western blot检测E-钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K)与磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B,p-AKT)表达水平。结果与空白对照组相比,β-榄香烯高剂量组A549细胞出现凋亡现象,各β-榄香烯组的A549细胞迁移数量均显著减少(P<0.05),β-榄香烯中、高剂量组A549细胞E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.05),Vimentin、p-PI3K与p-AKT蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论β-榄香烯能诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡,抑制上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)过程,进而减弱迁移能力,其作用机制可能与干扰PI3K/AKT信号通路的激活有关。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联合化疗药物对非小细胞肺癌细胞的作用机制研究

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）在肿瘤的免疫监视中起到一定作用。rhTRAIL可诱导肿瘤细胞凋亡。研究表明,大多数非小细胞肺癌细胞株对TRAIL抵抗,因此,我们研究化疗药物与TRAIL联合作用对非小细胞肺癌细胞的作用机制。

应用凝集素芯片检测非小细胞肺癌细胞膜表面糖链表达

目的应用凝集素芯片检测非小细胞肺癌细胞系A549和H460细胞膜表面糖链表达类型。方法用胶原酶Ⅱ消化非小细胞肺癌细胞系,对提取的细胞进行荧光标记,利用凝集素对糖链的特异亲和性捕获细胞,激光扫描仪检测细胞膜表面糖链表达。结果腺癌A549和大细胞肺癌H460除LTL和DBA这两个凝集素位点没有捕获到细胞外,其余各点均捕获到细胞。结论根据凝集素的亲和特异性表明,非小细胞肺癌细胞膜表面糖链类型主要有:唾液酸、乙酰葡萄糖、乙酰半乳糖、甘露糖和半乳糖糖链,为建立癌症细胞膜表面糖链表达谱和寻找肺癌分子靶向治疗的药物作用位点提供理论依据。

miR-7-5p靶向丝氨酸/苏氨酸激酶11调控非小细胞肺癌细胞A549的凋亡

目的探讨miR-7-5p是否靶向丝氨酸/苏氨酸激酶11(LKB1)调控非小细胞肺癌细胞A549的凋亡。方法通过TargetScanHuman分析miR-7-5p与LKB1的匹配情况,然后通过荧光素酶报告系统检测miR-7-5p是否靶向LBK1;miR-7-5p mimics过表达或者miR-7-5p inhibitor敲低miR-7-5p的情况下,通过免疫印迹检测凋亡相关蛋白质Cleaved-caspase3和Bax的表达量,AMPK的总蛋白和是p-AMPK的表达量;通过Annexin-V染色检测非小细胞肺癌细胞A549的细胞凋亡水平。结果 miR-7-5p靶向LKB1的3′UTR;过表达miR-7-5p后,LKB1的表达量下降(P<0.05),凋亡相关蛋白质Cleaved-caspase3和Bax的表达量上升(P<0.05),p-AMPK的表达量减少(P<0.05),非小细胞肺癌细胞A549的凋亡水平上升(P<0.05),但是此种效应能被AMPK的抑制剂BML-275抑制;敲低miR-7-5p后,LKB1的表达量下降(P<0.05),凋亡相关蛋白质Cleaved-caspase3和Bax的表达量下降(P<0.05),p-AMPK的表达量上升(P<0.05),非小细胞肺癌细胞A549的凋亡水平下降(P<0.05)。结论 miR-7-5p通过靶向LKB1的3′UTR通过AMPK通路促进非小细胞肺癌细胞A549的细胞凋亡。

右美托咪定对顺铂诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡及氧化应激的影响

目的探讨右美托咪定(Dex)对顺铂诱导的人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞凋亡的影响及其潜在机制。方法将人非小细胞肺癌细胞系分为3组:对照组、顺铂组和Dex组。采用Western Blot法检测各组细胞中凋亡相关蛋白、细胞色素C、mTOR/ERK1/2信号分子及E-钙粘蛋白的表达,采用试剂盒法检测活性氧(ROS)的含量。结果与对照组相比,顺铂组和Dex组Caspase 3、Caspase 9和Bax的表达显著增加(P<0.05),Dex组高于顺铂组(P<0.05)。与对照组相比,顺铂组和Dex组Bcl-2表达显著降低(P<0.05),顺铂组和Dex组间比较无显著差异。与对照组相比,顺铂组和Dex组ROS的含量及细胞色素C的释放显著增加(P<0.05),Dex组高于顺铂组(P<0.05)。Dex组p-mTOR和E-钙粘蛋白的表达显著低于对照组和顺铂组(P<0.05),对照组和顺铂组间比较无显著差异。与对照组相比,顺铂组和Dex组p-ERK1/2的表达显著降低(P<0.05),Dex组低于顺铂组(P<0.05)。各组间mTOR和ERK1/2的表达无显著差异。结论Dex可进一步促进顺铂诱导的肺癌细胞凋亡,机制可能与其抑制mTOR和ERK1/2增殖信号通路的活性及抑制E-钙粘蛋白的表达有关。

羟基喜树碱诱导非小细胞肺癌细胞株凋亡实验研究

目的应用流式细胞仪观察羟基喜树碱对非小细胞肺癌细胞株体外生长的影响,了解羟基喜树碱对非小细胞肺癌细胞株的效应,为临床治疗非小细胞肺癌提供理论依据。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,测定HCPT对非小细胞肺癌细胞株EBC-1和A-549的生长及集落形成的抑制作用,并绘制量-效曲线。流式细胞仪检测羟基喜树碱诱导非小细胞肺癌细胞株凋亡。结果羟基喜树碱对非小细胞肺癌细胞株的集落形成抑制试验明显呈剂量依赖性,HCPT和DDP对EBC-1(鳞状上皮)和A549(腺癌)的24h的50%抑制浓度(IC50)分别为67ng/L和154ng/L;4 950ng/L和58 101ng/L,明显高于顺铂(P<0.01),羟基喜树碱可诱导EBC-1和A549细胞株发生S+G_2/M期阻滞,HCPT引起凋亡,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论羟基喜树碱可显著诱导非小细胞肺癌细胞株发生凋亡,对EBC-1和A549细胞株体外增殖有明显抑制作用。

MERS-CoV调控非小细胞肺癌细胞A549补体系统抑制因子C4BPA的机制

目的探讨关于中东呼吸综合征-冠状病毒(middle east respiratory syndrome-coronavirus,MERS-CoV)调控非小细胞肺癌细胞A549补体系统抑制因子补体成分4结合蛋白Alpha(complement component 4 binding protein alpha,C4BPA)的机制。方法以是否MERS-CoV感染非小细胞肺癌细胞A549分为感染组和对照组,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹和实时荧光定量PCR(qPCR)分别检测2组细胞C4BPA的蛋白和mRNA表达情况。TargetScanHuman预测与C4BPA结合的miRNA,实时荧光定量PCR和荧光素酶报告试验确定靶向C4BPA的miRNA。在MERS-CoV感染的情况下,过表达或敲低靶向C4BPA的miRNA,ELISA或qPCR检测C4BPA的表达和分泌情况。同时分析人肺成纤维细胞和小鼠感染MERS-CoV后,C4BPA和miR-451b的表达情况。结果非小细胞肺癌细胞A549感染MERS-CoV后,其分泌的C4BPA增加(P<0.05)。通过TargetScanHuman在线分析和qPCR发现MERS-CoV抑制非小细胞肺癌细胞A549 miR-451b的表达(P<0.05),并且miR-451b靶向C4BPA的3‘UTR(P<0.05)。过表达miR-451b后,C4BPA的表达和分泌受到抑制(P<0.05)。敲低miR-451b后,C4BPA的表达和分泌受到促进(P<0.05)。同时,MERS-CoV感染人肺成纤维细胞和小鼠后,miR-451b的表达受到抑制(P<0.05),C4BPA的表达增强。并且,MERSCoV感染引起的C4BPA增多能够抑制补体经典系统的溶血活性。结论MERS-CoV通过下调miR-451b促进C4BPA的分泌。

菝葜体外抗非小细胞肺癌细胞活性物质研究

目的:筛选菝葜抗非小细胞肺癌细胞活性物质。方法:采用溶剂法、明胶沉淀法和大孔吸附树脂纯化技术,将菝葜提取分离为乙醇粗提物、总鞣质、总黄酮3个物质部位,利用细胞计数仪测定3种物质部位抗A549、NCI-H522、NCI-H23细胞存活率。结果:从菝葜提取分离的3种物质部位均有不同程度抗非小细胞肺癌细胞活性,其中鞣质部位致非小细胞肺癌细胞存活率最低,并在浓度范围内呈现出良好的计量依耐性。结论:鞣质为菝葜主要抗非小细胞肺癌细胞活性物质。

非小细胞肺癌细胞株TGFBR3基因缺陷表达及其分子机制研究

背景与目的国外有研究表明,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中转化生长因子受体III(TGFBR3)存在缺陷表达,但是分子机制尚未明确。本研究以正常支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cell,HBEpiC)为对照,分析NSCLC细胞株中TGFBR3基因的表达情况,并探讨TGFBR3基因表达失活的分子机制。方法采用Western blot检测HBEpiC和NSCLC细胞株中TGFBR3的表达情况并做相对定量分析;采用DNA直接测序检测TGFBR3基因启动子基本转录元件区的突变情况;应用亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite sequence-PCR,BSP)检测TGFBR3基因启动子区甲基化状态。结果NSCLC细胞株中TGFBR3表达水平明显低于HBEpiC;高转移细胞株95D明显低于非转移细胞株LTEP-α-2、A549、NCI-H460;HBEpiC与NSCLC细胞株中TGFBR3基因近端启动子区-165到-75区域无遗传突变,且未见甲基化,远端启动子区-314到-199区域均为高甲基化。结论TGFBR3基因在NSCLC细胞株中表达下调,在高转移细胞株95D中尤其明显,提示该基因的表达缺陷对NSCLC发生发展起重要作用,可能与NSCLC的侵袭和转移相关;然而,TGFBR3基因启动子区重要转录元件区域的甲基化状态并不是导致TGFBR3基因表达下调的主要原因。

重组变构人TRAIL对非小细胞肺癌细胞的体外抑制作用

目的研究重组变构人TRAIL(rmhTRAIL)对人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞和人正常细胞的生长、抑制作用及其与化疗药的联合作用。方法采用四唑盐(MTT)和集落形成试验法检测细胞的生长,并观察了与顺铂(DDP)联合应用对细胞生长的作用。结果rmhTRAIL对多种NSCLC细胞有显著的抑制作用,而对人正常细胞无影响;rmhTRAIL与DDP联合应用具有协同或增强对NSCLC细胞的抑制作用,而且对正常人细胞不表现毒性。结论rmhTRAIL是一种安全、有效的抗肿瘤生物制品。

m6A甲基转移酶METTL3介导miR-127调控非小细胞肺癌细胞系自噬的机制研究

目的 分析N6甲基腺苷(m6A)甲基转移酶3(methyltransferase-like 3, METTL3)和miR-127在非小细胞肺癌(non small cell lung cancer cells, NSCLC)细胞系中的表达及其相关性,并探究METTL3介导miR-127调控非小细胞肺癌自噬的作用机制。方法 采用qRT-PCR法检测正常肺上皮细胞BEAS-2B与非小细胞肺癌细胞HCC827,A549和H460中METTL3和miR-127的表达水平;通过Linked Domics数据库筛选出肺癌中与miR-127共表达的基因,并分析METTL3和miR-127之间的相关性;选择H460细胞传代培养至对数生长期后,将浓度接近的细胞随机分为三组,分别转染METTL3-siR,NC-siR及Control,验证转染后H460细胞中METTL3和miR-127表达;通过吖啶橙染色,Lyso-Tracker Red染色观察METTL3对细胞自噬的影响;利用Western blot检测PTEN,AKT,mTOR,ULK1,Beclin-1等自噬相关蛋白的表达。结果 非小细胞肺癌细胞HCC827,A549,H460中METTL3相对表达分别为1.35±0.17,1.54±0.11和1.78±0.21,明显高于正常肺上皮细胞BEAS-2B中表达水平(0.91±0.11),差异有统计学意义(F=34.037,P=0.002)。非小细胞肺癌细胞HCC827,A549,H460中miR-127相对表达分别为1.56±0.21,1.85±0.19和2.11±0.25,较正常肺上皮细胞BEAS-2B中表达(1.02±0.20)亦显著升高,差异有统计学意义(F=28.152,P=0.005)。肺癌中METTL3与miR-127共同表达呈正相关性(r=0.452,P <0.001)。METTL3-siR组细胞中METTL3表达水平(0.61±0.15)较Control组(1.71±0.28)和NC-siR组(1.65±0.19)显著降低,差异有统计学意义(F=78.357,P <0.001)。METTL3-siR组细胞中miR-127表达水平(0.48±0.15)较Control组(2.02±0.33)和NC-siR组(1.97±0.25)亦显著下降,差异有统计学意义(F=105.216,P <0.001);吖啶橙和Lyso-Tracker Red染色分别观察到METTL3-siR组细胞酸性自噬小泡增多,自噬溶酶体数量也明显增加。与Control组和NC-siR组相比,METTL3-siR组细胞中PTEN,ULK1,Beclin1蛋白表达水平显著升高,差异均有统计学意义(F=62.420~175.615,均P<0.001);p-AKT和p-mTOR表达水平显著下降,差异均有统计学意义(F=148.781,87.147,均P<0.001)。结论 METTL3和miR-127在非小细胞肺癌细胞系中均呈高表达,且它们之间呈正相关性,沉默METTL3基因可以抑制miR-127表达,促进非小细胞肺癌H460细胞发生自噬,其调控机制可能与PTEN/AKT/mTOR通路有关。