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兽医领域病毒宏基因组非序列依赖性单引物扩增方法的研究现状 被引量:2
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作者 徐利军 王晓泉 刘秀梵 《中国家禽》 北大核心 2017年第12期1-4,共4页
新一代测序技术的出现和不断完善,极大地推动了宏基因组学的发展。宏基因组学研究的路线主要包括核酸样本制备、高通量测序及生物信息学分析,而核酸样本的质量直接影响后续环节。目前有多种方法可以用于低浓度样本的扩增,其中非序列依... 新一代测序技术的出现和不断完善,极大地推动了宏基因组学的发展。宏基因组学研究的路线主要包括核酸样本制备、高通量测序及生物信息学分析,而核酸样本的质量直接影响后续环节。目前有多种方法可以用于低浓度样本的扩增,其中非序列依赖性单引物扩增(SISPA)法因其经济高效性,越来越受到研究者的青睐。文章就兽医领域病毒宏基因组学研究过程中广泛使用的相关SISPA方法进行概述,包括核酸样本的预处理及扩增方案等,为相关研究提供参考。 展开更多
关键词 病毒 宏基因组 序列依赖性引物 核酸样本制备
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基于非序列依赖性单引物扩增和纳米孔测序鉴别乙型流感病毒 被引量:2
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作者 叶福强 韩一芳 +5 位作者 陈乐如 罗正汉 王太武 胡丹 汪春晖 张锦海 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2022年第6期431-436,共6页
目的采用基于非序列依赖性单引物扩增(SISPA)技术的纳米孔测序确定一起不明原因聚集性发热疫情的病原体。方法对疫情中10名患者咽拭子样本抽提核酸后,采用SISPA合成cDNA并建立纳米孔测序文库,在测序仪MinION上测序,对测序数据进行分类... 目的采用基于非序列依赖性单引物扩增(SISPA)技术的纳米孔测序确定一起不明原因聚集性发热疫情的病原体。方法对疫情中10名患者咽拭子样本抽提核酸后,采用SISPA合成cDNA并建立纳米孔测序文库,在测序仪MinION上测序,对测序数据进行分类学分析和进化分析,最后用实时荧光定量PCR验证。并比较SISPA和随机引物反转录法的核酸富集效果。结果SISPA结合纳米孔测序技术,在8名患者样本中鉴别出乙型流感病毒核酸,检出率为80%。不同样本的乙型流感病毒序列数介于1~1618,单个基因1×覆盖度最高为99.77%。经实时荧光定量PCR验证,所有样本中均检出乙型流感病毒核酸,且Ct值与乙型流感病毒序列数呈负相关。将获得的一致性序列进行比对和进化分析,该序列与美国2022年2月报道的乙型流感病毒PB2基因序列一致性最高,达99.87%,并与美国近4年报道的乙流病毒亲缘关系较近,与我国河南、山东、江西、香港地区、台湾地区等地报道的乙流病毒同源性较低。SISPA富集扩增效果好于随机反转录法。结论SISPA结合纳米孔测序技术可用于聚集性疫情的病原学调查,在不明原因疫情处置中发挥关键作用,为疫情溯源提供参考。 展开更多
关键词 序列依赖性引物 纳米孔测序 聚集性疫情 病原学 进化分析
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新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定 被引量:87
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作者 黄欣梅 李银 +13 位作者 赵冬敏 刘宇卓 张敬峰 何孔旺 侯继波 钮慧敏 李彬 温立斌 王永山 邵国青 张康宁 朱江宁 吴东明 高磊 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第2期354-360,共7页
2010年4月至11月,江苏等地鸭、鹅发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,出现脑炎样神经症状为特征的传染病。对发病鹅进行剖检观察,鸭胚尿囊腔途径接种发病鹅病料分离病原,电镜观察病毒粒子。对健康鹅接种分离病毒进行动物回归试验。在... 2010年4月至11月,江苏等地鸭、鹅发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,出现脑炎样神经症状为特征的传染病。对发病鹅进行剖检观察,鸭胚尿囊腔途径接种发病鹅病料分离病原,电镜观察病毒粒子。对健康鹅接种分离病毒进行动物回归试验。在病毒核酸背景未知的情况下,应用非序列依赖性单引物扩增法结合DNA酶处理(DNase-sequence independent single primer amplification,DNase-SISPA)对病原基因进行扩增,并在此基础上设计了1对特异性引物对病毒基因进行PCR扩增。剖检结果发现病鹅的脑膜、肺脏、肝脏、心脏、卵巢等多器官出血,脾脏肿大坏死。含毒鸭胚尿囊膜超薄切片电镜观察显示:病毒粒子直径为50~60 nm。动物回归试验成功复制出该病并分离到病毒。应用DNase-SISPA方法发现了3个病毒相关基因片段,经序列比对分析,与黄病毒属(Flavi-virus)坦布苏病毒(Tembusu virus)基因序列有很高的同源性,分别为96%、88%、93%。据此设计特异性引物扩增出一段985 bp基因片段,该片段与黄病毒属坦布苏病毒E基因的核苷酸同源性为91%,氨基酸同源性为97%。将分离的鹅黄病毒毒株命名为Goose/Jiangsu/804/2010(简称JS804)。研究结果表明:此次鸭、鹅新发疫病的病原为一种新的黄病毒。 展开更多
关键词 非序列依赖性单引物扩增法 黄病毒 JS804毒株
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单纯疱疹病毒1型引起的发热出疹性疾病需要与手足口病进行鉴别 被引量:5
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作者 祝双利 刘建锋 +12 位作者 孙强 李静 李晓嫘 张勇 陈瑛 温小云 严冬梅 黄国虹 张宝敏 张波 安洪秋 李慧 许文波 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期415-420,共6页
对2008年在甘肃省发生的一起疑似手足口病(HFMD)的发热出疹性疾病的流行进行病原体的实验室检测,明确引起这起传染病流行的病原体。从4名发热出疹患者采集的8份临床标本中(每个患者采集咽拭子和疱疹液标本),首先将临床标本接种到RD和HE... 对2008年在甘肃省发生的一起疑似手足口病(HFMD)的发热出疹性疾病的流行进行病原体的实验室检测,明确引起这起传染病流行的病原体。从4名发热出疹患者采集的8份临床标本中(每个患者采集咽拭子和疱疹液标本),首先将临床标本接种到RD和HEp-2细胞上进行病毒分离,对病毒分离阳性的标本提取病毒核酸,然后使用荧光定量-逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行人肠道病毒(HEV)核酸的检测。对HEV检测结果阴性的标本采用序列非依赖的单引物扩增技术(SISPA)进行"未知病原体"的鉴定。分离到的6株病毒均鉴定为单纯疱疹病毒I型(HSV-1),结合分析这起流行中患者的临床表现、流行病学调查结果以及实验室检测结果,表明HSV-1是引起这起发热出疹性疾病流行的病原体。6株HSV-1的gG区核苷酸和氨基酸水平上差异都较小,同源性分别高达98.8%和97.9%,说明这起疫情是由同一个病毒传播链引起的。HSV-1等病毒引起的发热出疹性疾病需要与HFMD进行鉴别诊断,由于仅从临床症状和流行病学资料上判断引起发热出疹性疾病的病原体是非常困难的,因此,必须依赖于实验室的诊断。 展开更多
关键词 发热出疹性疾病 手足口病 序列依赖引物技术 纯疱疹病毒1型 A基因型
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感染性疾病RNA病毒性病原体生物信息学检测方法的建立
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作者 于庭 包洪 +2 位作者 刘爱忠 于艳辉 滕春燕 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第4期431-433,共3页
目的以艾滋病病毒(HIV)为研究对象,建立感染性疾病RNA病毒性病原体的生物信息学检测方法。方法应用DNase-非序列依赖的单引物扩增技术,将艾滋病患者血清过滤后,经DNase处理去除血清中的内源DNA,提取血清病毒RNA,反转录合成病毒RNA的双链... 目的以艾滋病病毒(HIV)为研究对象,建立感染性疾病RNA病毒性病原体的生物信息学检测方法。方法应用DNase-非序列依赖的单引物扩增技术,将艾滋病患者血清过滤后,经DNase处理去除血清中的内源DNA,提取血清病毒RNA,反转录合成病毒RNA的双链cDNA,TaqⅠ酶切双链cDNA,加接头分子,并以接头分子为引物非特异扩增病原基因;PCR产物克隆后,酶切鉴定并测序,经GenBankBLAST软件进行序列分析。结果非序列依赖的单引物扩增HIV患者血清中外源基因得到多个DNA片段;重组克隆质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,可见插入片段存在;将所有PCR产物测序,序列与已知病原基因序列一致。结论应用DNase处理及非序列依赖的单引物扩增方法可以检测RNA病毒性病原体。 展开更多
关键词 感染性疾病 RNA病毒性病原体 DNase-序列依赖引物 艾滋病病毒
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不同样本测序前处理方案对冠状病毒基因组高通量测序结果的影响 被引量:3
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作者 陈静 张雅薇 +4 位作者 牛培华 陆柔剑 朱娜 范航 谭文杰 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期103-109,共7页
目的以基因组最大RNA病毒(冠状病毒)为代表,研究不同测序前样本处理模式对高通量测序获得病毒全基因组序列信息质量的影响。方法以细胞培养的人冠状病毒HCoV-OC43样本为代表,分为4种测序前样本处理模式,即:未处理组、核酸提取前DNase和R... 目的以基因组最大RNA病毒(冠状病毒)为代表,研究不同测序前样本处理模式对高通量测序获得病毒全基因组序列信息质量的影响。方法以细胞培养的人冠状病毒HCoV-OC43样本为代表,分为4种测序前样本处理模式,即:未处理组、核酸提取前DNase和RNase处理组、核酸提取后DNase处理组、核酸提取前DNase和RNase处理且核酸提取后DNase处理组。不同模式处理后的核酸分为两份,一份直接RNA测序(未扩增),另一份经序列非依赖的单引物扩增(SISPA)后DNA测序。结果尽管不同处理方式下获得的病毒基因组覆盖率差别不大,但是样本核酸提取后经DNase处理组直接测序获得了最高的基因覆盖度和测序准确性,而SISPA扩增可有效提高病毒测序读长(reads)比例与基因组各位点的测序深度。结论本研究为优化冠状病毒等RNA病毒全基因组测序策略提供了技术参考。 展开更多
关键词 人冠状病毒 序列依赖引物 全基因组测序 高通量测序
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