丙型肝炎病毒NS4B蛋白调控Hep3B细胞非折叠蛋白质反应研究

研究表达的丙型肝炎病毒(HCV)NS4B对Hep3B细胞非折叠蛋白质反应的影响。NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染Hep3B细胞,G418筛选和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内XBP1 mRNA剪接,Western blot鉴定ATF6蛋白切割,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78和XBP1启动子活性。G418筛选和Western Blot鉴定证实获得稳定表达NS4B的Hep3B细胞;在该细胞内,XBP1 mRNA剪接、ATF6切割、XBP1和Grp78启动子激活均被检测到。NS4B在Hep3B的稳定表达诱导了非折叠蛋白质反应。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B诱导细胞非折叠蛋白反应

用RT-PCR和免疫印迹的方法检测稳定表达NS4B的HeLa细胞中的XBP1;通过RT-PCR的方法在表达NS4B的HeLa和Huh-7细胞中检测ATF6,Grp78和caspase-12的转录,并且通过报告基因的方法分析XBP1和Grp78启动子活性。实验结果表明:在表达NS4B的HeLa细胞中检测到XBP1的两种形式(剪接和未剪接),此外,在细胞中ATF6、Grp78的转录水平和XBP1、Grp78启动子的荧光素酶活性较没有表达NS4B的HeLa和Huh-7细胞中的量有所增加;通过染色质免疫沉淀实验(ChIP)分析,这些增加可能是由于XBP1结合到了这些基因的启动子上引起的。总之,实验结果可提示HCVNS4B通过ATF6或XBP1途径引起内质网压力,导致UPR反应。NS4B可能在HCV的致病性中起着重要的作用,特别是在慢性肝炎,甚至肝细胞癌中。

非折叠蛋白质应答对人胚肾细胞293A迁移特性的影响

为了研究非折叠蛋白质应答对器官发生的影响 ,应用衣霉素诱导非折叠蛋白质应答并观察其对人胚肾细胞系 2 93A迁移特性的影响。在实验中 ,应用划痕法对细胞迁移进行观察 ,并应用细胞黏附实验、荧光染色技术、扫描电镜技术及免疫印迹实验分别对细胞黏附特性、微管及微丝、细胞表面边缘的突起及小分子GTPase的表达水平进行研究。结果表明 ,非折叠蛋白质应答可以抑制细胞迁移 ,进一步的研究发现 ,非折叠蛋白质应答可以降低细胞的黏附能力、引起细胞骨架的重排、抑制伪足的形成并降低RhoA的表达水平。这提示 ,非折叠蛋白质应答可能通过抑制应激细胞的迁移为应激细胞的功能修复赢得了时间 。

非折叠蛋白反应——一条综合的细胞内信号通路

内质网(endoplasmic reticulum,ER)作为细胞中蛋白成熟的场所,可以很敏感的感受细胞内外环境的变化。当ER内环境改变,细胞就会激活信号应对这些改变,并且重新恢复折叠蛋白的环境。内质网的这种改变就是内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),而对这种应激作出的反应就是非折叠蛋白反应[1(]Unfolded Protein Response,UPR)。UPR至少引起了3种不同的信号通路,这些通路不仅调控分泌途径中大部分基因的表达,而且还广泛影响细胞的各个方面包括蛋白质、氨基酸和脂类的代谢。同时,这3条通路可以综合的调控细胞分泌器官的重塑并根据ERS重新调节细胞的生理活性。就UPR相关的感受器及其信号通路作简要的介绍。

过量氟对成骨细胞非折叠蛋白反应的影响

目的探讨钙连接蛋白(CNX)、钙网蛋白(CRT)和免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)在高氟处理人成骨细胞后引起非折叠蛋白反应中的作用。方法免疫印迹法测定不同浓度氟化钠处理人成骨细胞Saos-2 24 h后,细胞内CNX、CRT、生长停滞与DNA损害可诱导基因34(GADD34)和BIP蛋白表达水平。结果高氟能诱导成骨细胞内BIP表达量的增加,抑制CNX表达。对CRT蛋白表达影响较小,仅在氟化钠20 mg/L时表达增高。GADD34在所试细胞中不表达。绘制了4种蛋白相互作用的关系图。结论氟引起非折叠蛋白反应,分子伴侣CNX/CRT循环异常可能是氟骨症骨细胞受损的机制之一。

线粒体非折叠蛋白反应对运动性骨骼肌代谢稳态的调节作用

线粒体非折叠蛋白反应(UPRmt)是一种适应性应激反应通路,在运动性骨骼肌代谢稳态中起重要作用。UPRmt在运动、组织缺氧、氧化应激、禁食、钙离子稳态失衡和肌肉收缩刺激等能量应激下,将线粒体基质积累或产生的大量未折叠或错误折叠的蛋白质,通过上调核基因编码的线粒体分子伴侣热激蛋白60(HSP60)、热激蛋白70(HSP70)的表达,帮助发生错误折叠的蛋白恢复正常蛋白构象及协助新合成的蛋白发生正确折叠,将信号从线粒体转导至细胞核,此过程有助于维持线粒体内蛋白质的动态平衡和细胞存活,从而保证线粒体蛋白组的最佳质量和功能,维持线粒体功能完整,保证骨骼肌代谢稳态。运动训练可通过UPRmt使线粒体网络结构功能重塑,也可使线粒体蛋白的质量控制稳定,进一步巩固和优化线粒体功能,维持骨骼肌质量和功能完整性,从而稳定骨骼肌代谢功能的稳态,同时还能有效防治神经退行性疾病、肌肉功能异常、肥胖和II型糖尿病等代谢疾病的发生,也为线粒体等相关疾病的病理机制及防治措施提供新的理论依据。

6mm无缝线切口与非折叠式人工晶体植入术

目的:评价角膜缘后界6mm无缝线巩膜隧道切口白内障超声乳化摘除及非折叠式人工晶体植入手术的疗效。方法:以12点角膜缘后界为切点作6mm水平“一”字形巩膜隧道切口,对50例55眼白内障行超声乳化摘除与聚甲基丙烯酸甲酯非折叠式人工晶体植入手术。其中53眼术毕巩膜切口不作缝线,2眼因后囊膜破裂改为12mm切口囊外摘除术。结果:切口无缝线病例术后1周裸眼视力≥0.6占92.4％,≥1.0占50.9％;术后1个月视力≥0.6占98.1％,≥1.0占67.9％。术后1周与1个月平均散光分别为0.63±0.36D、0.61±0.33D,与术前平均散光0.60±0.48D相比,无明显差别(t检验P>0.05)。结论:角膜缘后界无缝线6mm巩膜隧道切口白内障超声乳化摘除及聚甲基丙烯酸甲酯非折叠式人工晶体植入术早期视力恢复快,术后角膜散光小,值得临床推广。眼科学报1999:15:262-264。

胰岛素抵抗的内质网非折叠蛋白反应机制与运动应激研究进展

内质网非折叠蛋白反应可以维持内质网中蛋白质的稳态,它与线粒体自噬通过线粒体—内质网相关膜紧密联系在一起,并通过影响胰岛素分泌和胰岛素抵抗来介导2型糖尿病的发生发展。运动应激是治疗2型糖尿病的有效手段,不仅可以激发内质网非折叠蛋白反应,还可以影响线粒体生物发生。但是,运动与胰岛素抵抗的内质网非折叠蛋白反应机制仍需研究,不同的运动方式和不同代谢类型的肌肉是否具有内质网非折叠蛋白反应特异性也有待探讨。对内质网非折叠蛋白反应与胰岛素抵抗、线粒体自噬和运动应激之间的关系进行了广泛的分析,旨在为2型糖尿病的运动防治提供新的思路。

大鼠视神经夹伤后视网膜节细胞的非折叠蛋白反应

目的:研究大鼠视神经夹伤后视网膜节细胞(retinal gan-glion cell,RGC)的非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。方法:成年雄性SD大鼠28只经视神经夹伤后,在4,8,12,24,72,168h,通过免疫荧光组织化学染色法观察RGC中非折叠蛋白相关因子(PERK,IRE-1,calnexin)、AMPA受体亚基GluR2的表达;采用Fluoro-JadeC法染色显示RGC凋亡状况,并与正常对照组比较。结果:大鼠视神经夹伤后,与正常对照组相比,RGC表达PERK,calnexin明显增强。从损伤后4h,阳性RGC细胞数增加,至24h时达到峰值,PERK,calnexin阳性细胞数分别为15.00±0.36和11.75±1.44个,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。从损伤后8h,RGC的IRE-1及GluR2表达增强,其中GluR2在胞膜上表达明显增强;Fluoro-Jade C染色在72h时RGC出现表达,并与GluR2的表达双标。结论:大鼠视神经夹伤后,与UPR相关的PERK,IRE-1,calnexin在RGC表达明显增强,提示UPR可能参与了RGC的凋亡。

非折叠蛋白反应在肿瘤免疫中的作用

非折叠蛋白反应(UPR)是细胞为克服内质网应激而引发的自身保护性反应,启动UPR主要依赖葡萄糖调节蛋白78和三个膜结合感受器分子。肿瘤细胞在生长、浸润和转移过程中经历的缺血、缺氧、营养剥夺等多种环境压力会对肿瘤细胞造成内质网应激,为克服内质网应激,肿瘤细胞会诱发UPR,通过内质网相关的降解、自噬等方式维持自身稳定并促进肿瘤的生存、进展和转移;同时,肿瘤细胞还可通过UPR适应并改变生存微环境,引发炎症并影响抗原提呈,从而抵抗机体免疫系统的攻击,促进肿瘤细胞的免疫逃逸。因此,UPR通路中的关键分子有望成为肿瘤免疫治疗的新靶点。

视神经损伤后发生非折叠蛋白反应的超微证据

目的:探索视神经损伤后视网膜节细胞(retinal ganglion cell,RGC)及其纤维渐进性死亡机制。方法:利用包埋前与包埋后免疫金细胞化学标记技术结合电镜观察研究大鼠(n=15)视神经钳夹损伤后RGC与视神经干少突胶质细胞内的非折叠蛋白反应(unfolding protein response,UPR)。结果:视神经钳夹后,需肌醇酶1(inositol requiring enzyme 1,IRE1)在RGC与少突胶质细胞内胶体金标记数目增多,在钳夹0.5d后RGC内即有显著地增加(18.4±5.1～30.4±7.2个,P<0.05),随损伤时间延长,增多更为明显,在钳夹3d后达高峰(48.5±9.7个),IRE1在视神经干上的少突胶质细胞内增多时程变化与在RGC内相似。IRE1在RGC与少突胶质细胞内胶体金标记颗粒分布部位距离ER管腔距离增加为特征,在钳夹0.5d内神经干少突胶质细胞以及视网膜RGC内均表现非常明显的距离增加。结论:视神经钳夹导致损伤细胞触发UPR,UPR可能参与视神经损伤后RGC及其纤维渐进性死亡机制。

内质网应激与非折叠蛋白反应激活对骨骼肌纤维免疫行为的调控作用

目的 探讨干扰素-γ(IFN-γ)诱导的炎症环境中,骨骼肌纤维内质网应激(ERS)与非折叠蛋白反应(UPR)的激活对肌纤维免疫行为的调控作用。方法 体外培养的C57BL/6小鼠原代成肌干细胞,经马血清分化成多核肌管后分成以下10组:1.对照组;2.IFN-γ组;3.衣霉素(TM)组;4.毒胡萝卜素(TG)组;5.IFN-γ+4-苯基丁酸(4-PBA)联合处理组;6.IFN-γ+TG+4-PBA联合处理组;7.IFN-γ+4μ8c联合处理组;8.IFN-γ+TG+4μ8c联合处理组;9.IFN-γ+GSK2606414联合处理组;10.IFN-γ+TG+GSK2606414联合处理组,并进行对应的处理。利用Real-time PCR检测相关肌细胞因子基因水平;免疫荧光观察UPR关键分子:真核翻译起始因子2α(eIF2α)、肌醇需要酶1α(IRE1α)、转录激活因子6(ATF6)在肌纤维内的表达;Western blotting检测肌细胞相关免疫分子和肌细胞因子及UPR关键分子;Luminex分析肌纤维内促炎症的肌细胞因子的蛋白水平。结果 IFN-γ诱导的炎症环境中,肌纤维H-2K~b、H2-Ea、Toll样受体3(TLR3)以及p-eIF2α、p-IRE1α表达上调;添加UPR抑制剂4-PBA的分组肌纤维H-2K~b、 H2-Ea、TLR3以及肌细胞因子的表达较IFN-γ组下调,添加IRE1α特异性抑制剂4μ8c的分组上述分子表达较IFN-γ组亦下调,而添加蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)特异性抑制剂GSK2606414的分组则无明显变化。结论 IFN-γ诱导的炎症环境中,UPR-IRE1α通路激活并抑制肌纤维免疫相关分子合成,从而进一步抑制肌纤维介导的免疫反应,有利于肌再生。

折叠人工晶状体与非折叠人工晶状体植入术后晶状体后囊膜混浊的临床观察

目的 评估植入不同人工晶状体术后发生后囊膜混浊 (posterior capsular opacification,PCO)的临床意义。方法 将折叠人工晶状体与非折叠人工晶状体植入患者分为两组 ,观察术后 6个月 PCO的发生情况 ,并进行相应统计分析。结果 折叠人工晶状体组患者术后发生 PCO的可能性较小 ,而且在发生不同程度的 PCO患者中 ,折叠人工晶状体组发生 PCO的程度较轻。结论 行折叠人工晶状体植入术治疗白内障对减少发生 PCO有一定临床意义。

氧化还原状态与非折叠蛋白的研究进展

在许多生理过程中,细胞内的氧化还原状态(Redox)与非折叠蛋白反应(Unfolded protein response UPR)对于细胞的生存和死亡有着重要的意义。本文探讨了UPR的氧化还原机制,其中包括蛋白质二硫键异构酶与ER应激的直接相互作用,Redox与钙离子外流,细胞的氧化还原能力与UPR信号通路。

未折叠蛋白反应在非酒精性脂肪性肝病中的作用研究进展

内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)下的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)可调节脂质代谢,与非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的进展有极大的相关性。当肝细胞在受到某些刺激,如缺氧或氧化应激时,会发生ERS,启动UPR以恢复细胞稳态。ERS又有急性ERS和慢性持续性ERS两种形式,急性ERS所触发的UPR是维持细胞稳态的重要反应机制,而慢性持续性ERS会启动细胞的凋亡程序,诱导细胞凋亡,与NAFLD的发生发展密切相关,其可能是NAFLD进程中的关键因素。本文回顾了NAFLD进展与UPR的联系,从脂质代谢、自噬角度讨论了UPR与NAFLD的关系,以期进一步深入了解NAFLD的发病机制,为NAFLD的预防和治疗提供指导。

嗜肺军团菌调控宿主非折叠蛋白反应的研究进展

内质网作为细胞内重要的细胞器之一,参与胞内蛋白的成熟及转运,其稳态与细胞的存活及免疫反应密切相关.非折叠蛋白反应是维持内质网稳态的重要机制之一,参与细胞的天然免疫反应,在宿主细胞抵抗病原体入侵中具有重要作用.嗜肺军团菌是一种革兰氏阴性致病菌,能够感染人体肺泡巨噬细胞引起严重肺炎,即军团菌病.在入侵宿主细胞后,嗜肺军团菌通过其Ⅳ型分泌系统将330多个效应蛋白转运至宿主细胞中,干扰宿主细胞的多种细胞进程,以形成其生存和复制所需的场所——含嗜肺军团菌囊泡(Legionella-containing vacuole,LCV).LCV的形成与宿主细胞的内质网密切相关.本文主要从嗜肺军团菌的致病机制、细胞非折叠蛋白反应及其与病原体的关系、军团菌对宿主细胞的非折叠蛋白反应的调控等方面进行综述,以期为揭示病原体与内质网应激之间的关系提供参考.

病毒诱导的非折叠蛋白反应调控天然免疫的研究进展

病毒在感染细胞后,病毒借助细胞内质网(Endoplasmic reticulum, ER)进行病毒基因组的部分蛋白表达,造成内质网压力过载。内质网会通过非折叠蛋白反应(Unfolded protein response, UPR)维持其自身的稳态,UPR包括PERK、IRE1、ATF6信号三种信号途径,并且会通过不同机制调控病毒的复制。在本综述中,简要综述了由病毒所介导的UPR对于抗病毒天然免疫反应的调控作用,并且本综述也对几种冠状病毒通过诱导UPR调控天然免疫反应进行了简要概述,以期为了解病毒复制提供参考。

与胰岛素基因突变所致青少年型糖尿病相关的突变型胰岛素原对细胞非折叠蛋白反应信号通路的影响

目的观察胰岛素基因突变所致的青少年型糖尿病（MIDY）其突变型胰岛素原对非折叠蛋白反应（UPR）信号通路的影响，探讨错误折叠的胰岛素原导致内质网应激（ESR）、B细胞功能衰竭的分子机制。方法用含有小鼠野生型胰岛素原（正常对照组）和3种突变型胰岛素原cDNA的重组质粒C（A7）Y、G（B8）S、G（C28）R分别转染293T细胞，转染72h后收集细胞分为两组，一组细胞提取总RNA，采用SQRT—PCR法检测剪切型和非剪切型x．盒结合蛋白（XBP-1）mRNA的表达。另一组细胞提取蛋白，采用Western blotting技术检测细胞中真核细胞转录起始因子α（eIF2α）和磷酸化eIF2α（p-eIF2α）的蛋白表达。采用单因素方差分析及t检验进行统计学分析。结果与正常对照组相比，c（A7）Y组和G（B8）S组剪切型/非剪切型XBP-1mRNA比值均升高，差异均有统计学意义[C（A7）Y组（0．84±0．17），G（B8）S组（0．70±0．16），与正常对照组（0．52±0．16）相比，t=3．17、2．35，均P〈0．01]；G（C28）R组与正常对照组相比差异无统计学意义[G（C28）R组（0．55±0．14），t=0．30，P〉0．05]。计算各组p-elF2α/eIF2α比值，C（A7）Y组和G（B8）S组与正常对照组相比均升高，差异均有统计学意义[正常对照组（0．10±0．01），C（A7）Y组（0．35±0．03），G（B8）S组（0．27±0．02），t=13．57、9．37，均P〈0．01]，G（C28）R组与正常对照组相比差异无统计学意义[G（C28）R组（0．08±0．01），t=1．09，P〉0．05]。结论与MIDY相关的突变型胰岛素原c（A7）Y和G（B8）S可引发细胞UPR和ERS，错误折叠的突变型胰岛素原可能是通过激活IRE1-XBP1和PERK—eIF2α-ATF4信号传导通路来诱发UPR的。

非折叠蛋白反应信号通路与糖尿病

蛋白质正确折叠需要一套复杂的内质网蛋白复合体的调节机制。在缺氧、氧化应激、异常糖基化反应以及钙离子稳态失衡等情况下，非折叠蛋白质增多。当超出内质网的处理能力时，可导致内质网应激（ERS）。细胞自身通过改变其转录和翻译过程，减少蛋白质的合成，降低进入内质网内蛋白质的数量，同时上调内质网中分子伴侣和蛋白折叠的表达，增强内质网的蛋白折叠功能；

非折叠蛋白反应在人体疾病发生和发展中的作用

非折叠蛋白反应(UPR)是维持细胞内质网稳态的一种适应性反应。内质网通过激活未折叠蛋白反应对细胞起到适应性保护作用。UPR对外界刺激和细胞生长信号做出的反应,称为内质网应激(ERs)。目前认为,UPR通过三种不同的信号转导途径既增加ER的容量,提高其折叠蛋白的能力,又显著降低折叠错误的蛋白质,并减少进入ER蛋白质的数量,发挥缓解ERs的作用。大量的资料显示,UPR和癌症、感染、代谢性疾病等多种人类疾病的发生和发展密切相关。