人卵泡壁层颗粒细胞源性非整合诱导多能干细胞的制备

目的探索将卵泡液中壁层颗粒细胞诱导为非整合的诱导多能干细胞(iPS细胞),并检测其颗粒细胞方向的分化能力。方法在取卵的操作过程中,收集废弃的壁层颗粒细胞,在颗粒细胞培养至第4天时,加入iPS仙台病毒,经过20余天的维持,挑取iPS细胞克隆,并扩增培养。对其多能基因表达情况、外源基因整合情况、自然分化能力、颗粒细胞定向分化能力进行鉴定,并与皮肤细胞来源的iPSC系进行平行分化能力比较。结果成功建立了壁层颗粒细胞来源的iPS细胞系,其通过了类似胚胎干细胞的多能性检测及体外三胚层的分化能力检测,尤其在定向分化为颗粒细胞时,分化出了大量FOXL2、CYP19A1和FSHR阳性的细胞,经ELISA试剂盒检测,发现该分化细胞可以分泌AMH并且能够将雄激素转化成雌激素;且颗粒细胞源iPS系较皮肤细胞源的iPS系在颗粒细胞方向的分化效率更高。结论提供了一种从人颗粒细胞建立iPSC的方法,并验证了其颗粒细胞方向分化的优势。该系统不仅可以用于建立生殖不孕疾病的iPSC库,还为颗粒细胞功能障碍不孕的患者提供了一种细胞治疗的新思路。

用非整合重编程技术构建人外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞

目的用非整合重编程技术构建人外周血单个核细胞(PBMC)来源诱导多能干细胞(i PSC)。方法收集健康人外周血标本,分离PBMC,用含4个重编程转录因子(OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC)的仙台病毒感染PBMC,并用无饲养层细胞的培养体系培育获得i PSC。通过细胞形态学、碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色、拟胚体形成和分化实验对i PSC细胞进行多能性验证;用核型分析和仙台病毒基因组RNA检测对其进行安全性验证。结果在仙台病毒感染后16 d后,PBMC出现i PSC样克隆。i PSC可进行传代培养,且经多能性验证实验证明其具有多能性;安全性验证结果表明,i PSC核型正常,外源性病毒基因组RNA可被完全清除。结论建立了对PBMC进行非整合重编程的诱导体系,并获得了具有多能性、核型正常且不含外源基因的i PSC。

建立非基因整合原发性骨髓纤维化诱导性多能干细胞株

目的:利用诱导多能性干细胞(iPSC)技术建立原发性骨髓纤维化(PMF)诱导多能性干细胞系,为研究血液病的发生发展提供一个实验模型。方法:采用非基因整合型质粒重编程携带JAK2V617F突变的PMF患者骨髓来源的单个核细胞,诱导生成该患者特异的iPS细胞株。结果:采用此方法建立的iPS细胞株,在体外能够稳定传代,无外源性基因整合,多能性基因表达水平与人胚胎干细胞类似,在体内具有形成三胚层结构的能力。测序结果显示,所建立的患者的iPS细胞株携带不同负荷的JAK2V617F突变。结论:成功地建立非基因整合的PMF患者特异的iPS细胞株,这为研究PMF的发病机制、化疗药物筛选及实现精准化治疗提供了一个重要的疾病模型。

无精症患者非基因整合诱导多能干细胞系的建立

目的利用非基因整合方法建立无精症患者的诱导多能干细胞系(iPSCs)。方法采用目前商品化的无血清完全培养基(TeSR?2)和胚胎干细胞培养基(Stem Adhere? Defined Matrix)限定培养体系,利用非基因整合的仙台病毒感染无精症患者外周血单个核细胞,建立了无精症患者的i PSCs系,应用免疫荧光、核型分析、拟胚体和畸胎瘤实验对iPSCs系的多能性、核型及分化能力进行鉴定。结果建立的iPSCs系具有人胚胎干细胞的特征。免疫荧光显示,干细胞多能性标志基因表达的八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定基因相关蛋白2(SOX2)以及干细胞特异表面抗原阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤排斥抗原-1-60(TRA-1-60)均阳性;核型分析显示其具有正常的核型;拟胚体和畸胎瘤实验显示其在体外和体内具有向3个胚层分化的能力。结论利用非基因整合方法成功构建了无精症患者的诱导多能干细胞系。

两种非整合载体重编程人脐带血CD34^+细胞形成诱导多能干细胞的研究

目的探索两种非整合载体重编程人脐血来源的CD34^+细胞形成诱导性多能干细胞(iPSCs)的方法。方法利用细胞核转染仪分别将两组非整合质粒转入短暂培养后的脐带血CD34^+细胞中,使其进行重编程形成iPSCs,14d后两种方法均可观察到2×10~6个脐带血CD34^+细胞中约有900个类似ES细胞特征的克隆出现,并对产生的iPSCs进行体内外多能性鉴定及细胞核型检测。结果两种方法重编程效率基本相同,重编程形成的hiPSCs多能性基因OCT4、SOX2、NANOG的表达量与hES细胞系H1比较接近(P>0.05),而与CD34+细胞差别较大(P<0.05),且具有体内分化成三胚层的全能性。结论两种非整合质粒重编程人脐带血来源的CD34^+细胞形成iPSCs的方法,效率基本相同,均无外源基因插入,为建立相对安全的iPSCs提供了有效途径,为临床科研、药物筛选和再生医学研究等提供了较好的方法。

非基因整合建立人诱导多能性干细胞方法的优化研究

诱导多能性干细胞(iPSC)技术具有临床应用前景,但iPSC的遗传稳定性和成瘤性阻碍了其可能的临床应用。非整合质粒(Episomal)方法无外源基因整合到宿主基因组上并且方法简单,适宜推广,是目前保证iPSC遗传安全性的最佳方案之一,但其诱导效率偏低,严重阻碍了其应用。本研究旨在优化Episomal方法,将脐血单个核细胞(CB MNC)重编程为诱导多能性干细胞(iPSC),建立无基因整合的iPSC的高效生成技术体系,为以后建立疾病iPSC奠定基础。利用CB MNC,通过比较不同氧含量,诱导质粒,MNC培养方法和预刺激时间等条件对Episomal方法进行优化。结果表明:CB MNC采用红系培养液,培养8 d,使用启动子为SFFV(spleen focus forming virus)的Episomal载体,在低氧(3%)条件下诱导,CB MNC重编程效率最高,可达到0.12%。通过分析最佳条件下供体细胞成分发现,表型为CD36+CD71+CD235alow的有核红细胞是重编程最主要的供体细胞来源。结论:本研究成功建立并优化出一种可推广的高效安全的,可以用于临床应用研究的iPSC诱导技术。

整合素和E-钙黏素在诱导多能干细胞重编程及干性维持中的作用

背景:诱导多能干细胞在疾病模型和再生医学领域具有广阔的应用前景,能够利用安全高效的方法进行体细胞重编程是诱导多能干细胞广泛应用于临床的前提。近年来研究者们发现细胞黏附分子整合素和E-钙黏素对诱导多能干细胞重编程和干性维持有重要影响,对其分子机制的研究将帮助研究者设计更加安全有效的重编程方法和深入全面的理解重编程过程。目的:从机制层面对整合素和E-钙黏素在诱导多能干细胞重编程及干性维持中的作用进行归纳总结。方法:由第一作者检索Web of Science数据库2006年至今有关细胞黏附影响诱导多能干细胞重编程及干性维持的文献,从中挑选63篇与研究目的相关性较强,质量较高的文章进行总结。结果与结论:整合素介导的细胞-基质间黏附与E-钙黏素介导的细胞-细胞间黏附可分别激活下游信号通路调控多能性基因表达,还可以作用于细胞骨架与核膜直接连接,通过多种机制产生基因水平、蛋白质水平和表观遗传学水平上的变化,最终影响诱导多能干细胞重编程及干性维持。

地中海贫血“integration-free”诱导多能干细胞的建立及造血分化的研究

目的:建立无外源基因整合(integration-free)的地中海贫血患者特异诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSC),并研究其向造血前体细胞分化的可能性。方法:用核转染的方法将表达Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28转录因子的质粒p EB-C5以及表达SV40大T抗原的质粒p EB-Tg导入引产巴氏水肿胎皮肤成纤维细胞中,将其重编程为i PSC后检测其向3个胚层细胞分化的特性。将i PSC细胞与小鼠OP9细胞共培养向造血前体细胞诱导分化,检测造血前体细胞特异性抗原。结果:成功建立了巴氏水肿胎皮肤成纤维细胞来源的α地中海贫血患者特异i PSC系,其具有向3个胚层分化的能力,与OP9细胞共培养9 d后可检测到造血前体细胞标记CD34的阳性率为18.7%,CD34和CD45双阳性为12.2%。结论:巴氏水肿胎皮肤成纤维细胞可成功诱导成"integration-free"i PSC,该细胞系具有向3个胚层分化的能力,与OP9共培养可向造血前体细胞分化。

生物钟基因Clock对小鼠诱导性多能干细胞分化的影响

目的研究生物钟基因Clock对小鼠诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)非定向分化的作用。方法将Teto-FUW-OSKM、M2rtTA、PsPAX2和PMD2.G4种质粒共转染293FT细胞,收集病毒上清,转染小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)获得小鼠iPSC,并通过检测多能性基因表达及其体外分化能力对小鼠iPSC进行鉴定;通过RT-PCR检测小鼠iPSC在非定向分化和拟胚体形成过程中生物钟基因的表达,以及生物钟基因Clock下调后,与野生型细胞相比小鼠iPSC多能性基因的表达和形态学改变。结果通过慢病毒感染MEF的方式获得了小鼠iPSC;小鼠iPSC在非定向分化过程中,生物钟基因Clock、Per2、Rev-erbα表达升高;生物钟基因Clock下调后,小鼠iPSC分化能力下降,多能性基因Sox2、Oct4、Klf4表达升高。结论生物钟基因Clock对小鼠iPSC的非定向分化起到重要作用。

人诱导多能干细胞用于亨廷顿病大鼠模型的移植治疗

目的探讨用于亨廷顿病(HD)治疗提供的药物筛选模型。方法 SD大鼠45只,分为正常对照组、毁损组、移植组三组,每组15只。正常组不予以处理,其余两组均用奎宁酸(QA)脑内注射,移植组在QA毁损模型建立后进行人诱导多能干细胞(hiPSC)移植。hiPSC在大鼠脑内存活了7 w,通过阿扑吗啡诱导旋转实验等行为学实验,观察各组大鼠运动功能情况;通过高十字迷宫、新环境抑制进食实验,观察各组焦虑类似的行为变化。结果与QA组相对比,观察到hiPSC移植组大鼠运动功能得到改善,大鼠焦虑类似的行为明显减少。hiPSC移植组大鼠的活动减少。结论hiPSC移植可以有效的改善HD大鼠的行为缺陷,hiPSC在治疗神经退行性疾病特别是HD,是一种理想的多潜能干细胞来源。

质粒重编程诱导多潜能干细胞及定向分化神经干细胞

目的探讨游离质粒载体重编程诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)为非整合型诱导多潜能干细胞,并在体外定向分化为神经干细胞(neural stem cells,NSCs),为神经干细胞移植治疗神经损伤提供稳定、安全的细胞来源。方法使用电转仪将质粒p EP4-EO2S-ET2K转入小鼠MEFs,经诱导培养重编程为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs),i PSCs在不同诱导培养基中经2次悬浮及贴壁培养分化为NSCs,在体内及体外实验鉴定i PSCs多向分化潜能特性及NSCs特性。结果体内外实验显示i PSCs具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)相似的多向分化潜能,且不整合外源性基因。i PSCs进一步分化的NSCs其相关标志基因表达与野生型NSCs相近,且较i PSCs显著增加,免疫荧光显示NSCs高表达NSC标志物NESTIN及PAX6,在体外存活能分化为神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞。结论游离质粒能重编程诱导非整合型i PSCs,并定向分化为神经干细胞及神经元,是神经损伤修复的理想种子细胞。

自闭症谱系障碍的遗传因素解析及干细胞模型研究进展

自闭症谱系障碍(ASD)是一种具有明显遗传倾向的神经发育障碍疾病,其主要症状是社会交往障碍,语言交流障碍和重复刻板行为。近些年来,ASD的患病率表现为逐年上升,以儿童和青少年居多,给家庭和社会带来了沉重的教育与经济负担,全社会对于ASD的发病机制以及临床遗传检测日益关注。近些年来由于高通量测序技术的大规模应用及诱导多能干细胞技术的发展,在分子水平发现了许多新的ASD易感基因以及非编码突变,基于这些突变建立了新的ASD遗传检测手段;同时也借助ASD病人来源的诱导多能干细胞进行了发病机制的深入研究。本文将从ASD相关的基因组变异、遗传检测及ASD干细胞模型研究三方面的进展进行综述,希望进一步提高全社会对ASD的发病机制及遗传特征的认识,从而更有效地预防和治疗ASD。

长链非编码RNA-ROR功能的研究进展

在人类基因组中,存在大量的非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs).近年来随着研究的发展,这些ncRNA已成为继microRNAs和siRNAs之后又一研究热点.长链ncRNA-ROR(large intergenic ncRNA-regulator of reprogramming,lincRNA-ROR),是最新发现对细胞重编程过程具有重要调控作用的长链非编码RNA.现有的研究表明,ROR在诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)形成、DNA损伤、氧化应激等过程中发挥重要的作用;此外,在肿瘤中,目前发现ROR与乳腺癌、肝癌的发生、转移等密切相关.ROR拥有丰富的生物学功能,但其具体的作用机制尚不明确.本文就ROR的研究背景、发现过程、功能及特点做一概述,对其在肿瘤上的作用及相关调控机制的进行探讨.

诱导性多能干细胞重编程技术的发展

近年来,研究者已经能通过重编程技术从多种物种与组织中获得具有多能性的干细胞系,被称为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)。这种细胞或可被应用于生物学及医学等多个领域,如疾病模型、自体细胞治疗、药物毒性筛选及相关基础研究。自2006年第一批i PSCs诞生以来,研究者致力于改进原始诱导方法以获得更高的诱导效率并降低诱导引起的基因组不稳定性。为了使读者能够更好地理解i PSCs的重编程技术,本文归纳总结了近年来已经使用过的一些主要诱导手段,并介绍了其优劣之处。这些研究成果均为今后i PSCs应用于临床实验奠定了坚实的理论基础。

梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织来源iPSCs系的建立

目的利用梗阻性无精子症(OA)和非梗阻性无精子症(NOA)患者的睾丸组织建立诱导性多能干细胞(iPSCs)系,比较两者建系过程有无差别。方法分别取3例OA患者和特发性NOA患者5～6 mm^3的睾丸组织,组织块培养方法进行原代培养,传至3～4代转染仙台病毒,待细胞增殖满后转移至饲养层细胞上继续培养,第21～22天挑取克隆,建立iPSCs系并进行多能性和分化能力的鉴定。结果两株iPSCs系均成功建立,建系过程无明显差异,碱性磷酸酶(AP)染色均为阳性;八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定基因相关蛋白2(SOX2)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤排斥抗原-1-60(TRA-1-60)的免疫荧光染色均为阳性;小鼠体内的畸胎瘤实验也表明获得的两株iPSCs系具有向3个胚层分化的潜能。结论利用仙台病毒非基因整合方法,OA患者和特发性NOA患者的睾丸组织均能建立iPSCs系。

非编码RNA对干细胞命运的调控及其分子机制

干细胞研究的发展为人类重大疾病的治疗提供了新的途径和希望。已知多种调控因子影响干细胞的功能和应用,探讨干细胞增殖分化调控机理的基础理论研究将大大推进干细胞的临床应用。近年来,研究发现非编码RNA分子能够调控干细胞的功能。为此,2011年国家重大科学研究计划设立重大科学问题导向项目——非编码RNA对干细胞命运调控的机制研究。在该项目的资助下,项目组在非编码RNA对干细胞命运的调控机理研究方面取得一批原创性的研究成果。本文总结了项目组取得的突破性研究进展及存在的问题和未来的发展方向。

建立非基因整合iPSCs体系及提高体外造血分化体系的研究

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)在体外可被诱导分化为多种细胞,该项技术在细胞治疗、药物筛选及疾病研究上具有广阔的前景。体外定向诱导其向造血分化可为临床上使用的造血干细胞提供一种新的来源,提高i PSCs的造血分化效率将是i PSCs临床前治疗要解决的关键问题。该研究采用非整合型病毒重编程正常人的外周血来源的单个核细胞(peripheral blood-derived mononuclear cells,PBMCs),诱导生成i PSCs后对其进行体外造血分化实验。结果显示,通过此种方法进行重编程的i PSCs可稳定传代,体内外均可向三胚层分化。使用OP9细胞与i PSCs共培养可分化为造血干/祖细胞,且添加细胞因子可有效提高分化效率。该研究为进一步提高i PSCs造血分化效率提供了重要的实验依据。

缝隙连接蛋白26缺陷聋的神经细胞中缝隙连接蛋白的表达差异

目的:通过诱导多能干细胞(iPSCs)技术获得缝隙连接蛋白26(Cx26)缺陷聋患儿的神经细胞,研究Cx26缺陷对神经细胞发育和基因表达的影响。方法:从3例Cx26缺陷造成的极重度耳聋患儿取得成纤维细胞,将之诱导为数个非整合iPSC细胞系,鉴定这些细胞系的形态和内源性、外源性基因表达。然后将这些细胞系向神经细胞方向分化,检测整个过程中形态、多能性基因、神经标记物、缝隙连接蛋白基因表达变化。结果:能够成功建立Cx26缺陷的3个iPSC细胞系,并且可以在体外分化为神经前体细胞和神经元细胞;这些细胞的形态、增殖、内源性、外源性基因表达与人胚胎干细胞基本一致;iPSC细胞系分化出的神经元细胞中,Cx32的表达明显上调,Cx36的表达略微上调,Cx26的表达没有明显变化。结论:Cx26缺陷不影响诱导多能干细胞的神经分化,但其过程中Cx32和Cx36表达上调,提示Cx32可能对Cx26缺陷发挥了代偿作用。