HRM-非标记探针法检测IL-15基因SNPs方法的建立

目的建立用于检测白细胞介素-15(IL-15)基因单核苷酸多态性(SNP)位点的高分辨率熔解曲线(HRM)-非标记探针的方法。方法采用HRM-非标记探针法及小片段扩增法对80名健康儿童IL-15基因4个SNPs位点进行基因分型,采用基因测序法进行验证并同时与小片段扩增法分型结果进行比较。结果 HRM-非标记探针法与基因测序分型结果一致,准确率为100%;未加入温度内标的小片段扩增法不能区分野生纯合子和突变纯和子。结论 HRM-非标记探针法是对已知SNP位点突变研究的一种廉价、简便、准确的基因分型技术,适合于对已知的SNP位点或基因突变进行分型和检测。

高分辨率熔解曲线法的非标记探针基因分型技术

PCR反应中利用荧光检测技术对已知位点进行基因分型时常采用荧光标记的寡核苷酸做探针。近年来新兴起的高分辨率熔解曲线技术可以采用非标记的探针对已知位点的SNP(single nucleotide polymorphism)或突变进行基因分型研究。采用非标记探针法对已知位点的基因分型研究具有廉价、快速、简便等特点,因此被大量应用在和疾病、形状等相关的一些多肽位点的研究中。本文较详细地介绍该技术的基本原理和实验中的注意事项。

非标记探针高分辨率熔解曲线技术检测HBV P区rt204位点耐药突变

目的 建立一种基于非标记探针高分辨率熔解曲线技术(HRM)检测HBV P区rt204位点耐药突变的方法.方法 构建野生株rt204M、突变株rt204I和rt204V的质粒,设计、优化探针.利用质粒作为标准品建立HRM特征性解链图谱.收集2010年5月至2012年5月宁波大学附属医院诊治的185例慢性乙型肝炎患者外周血样本共185份,用HRM技术检测所有样本,并与特征性解链图谱比对,筛选出rt204位点的突变,再经基因测序验证.采用配对x2检验比较两种方法的变异检出率.结果 突变株rt204I、rt204V和野生株rt204M的熔解温度(Tm)分别为58.0℃、60.6℃和62.5℃；185份样本中,HRM技术成功分析168份(90.8％),基因测序成功分析155份(83.8％),二者差异有统计学意义(P＜0.01)；同时被两种方法检出的155份临床样本中,非标记探针HRM技术检测到野生株75份(rt204M),变异株80份(55份rt204I、25份rt204V),变异检出率为51.6％(80/155)；基因测序法检测到野生株110份(rt204M),变异株45份(30份rt204I、15份rt204V),变异检出率为29.0％ (45/155),两种方法差异有统计学意义(P＜0.01).结论 非标记探针HRM技术是一种简单、灵敏、快速、特异的HBV P区rt204位点耐药突变检测方法.

牛脊柱畸形综合征HRM-非标记探针检测方法的建立与应用

为建立用于牛脊柱畸形综合征（CVM）检测的高分辨率熔解曲线（HRM）非标记探针法,根据Gen Bank中SLC35A3基因序列设计PCR引物及非标记性探针,构建G/G型、G/T型、T/T型3种标准质粒,利用质粒作为标准品建立HRM特征图谱。采用优化的HRM-非标记探针法对305份荷斯坦奶牛血样及冷冻精液样品中SLC35A3位点的基因型进行检测,同时采用测序法进行验证。结果,305份样本中9份冻精样本为CVM携带者,携带率为2.95%,检测结果与测序法检测结果一致,准确率达100%。上述研究结果表明,本研究建立的针对牛CVM中SLC35A3基因G-T位点突变检测的HRM-非标记探针方法是一种简单快速、灵敏特异、高效准确的牛CVM有害基因分型检测技术。

非同位素标记探针杂交分析白细胞端粒DNA长度

目的建立用非同位素标记探针杂交测定端粒DNA长度的方法,并探讨其法医学的应用价值。方法酚/氯仿抽提基因组DNA,限制性内切酶消化,0.8％琼脂糖凝胶电泳,Southern印迹,化学发光法检测端粒DNA谱带,与标准分子量DNA比较,积分光密度扫描计算端粒DNA平均长度。结果所测样本获得了较好的低背景杂交谱带,测得31~35岁端粒。DNA的平均长度为11.71kb,51~55岁平均为11.04 kb。结论用上述建立的方法初步显示年龄与端粒长度之间有一定的相关性,为法医学年龄的推断开辟了一个新的研究领域。

地高辛配基标记DNA探针检测HLAⅡ类基因技术的建立

本文报道了采用序列特异性寡核苷酸探针杂交(SSOPH)检测HLAⅡ类基因(DRB、DQB)多态性的方法。实验包括少量全血提取模板DNA、PCR基因扩增基因多态性区域片断、尼龙膜点样、特异性寡核苷酸探针合成及地高辛配基(DIG-11-ddUTP)标记、探针杂交;条件洗涤、化学发光显影等一系列步骤。该实验方法具有用血量少、结果精确稳定、操作简便安全、不污染环境等优点。作者对模板DNA的提取、杂交缓冲液制备、标记探针的使用剂量以及条件洗涤等多个环节作了改良,使实验方法和结果进一步优化。

应用基于HRM的LunaProbe技术检测2型糖尿病易感基因FTO的三个变异位点

目的:建立糖尿病易感基因FTO中三个变异位点的非标记探针(LunaProbe)检出方法,初步进行临床应用。方法:基于高分辨率熔解曲线(HRM)技术,通过控制PCR产物长度和非标记寡核苷酸探针的特异性设计,通过Idaho LightScanner分析,建立FTO基因rs8050136、rs9939609和rs9930506的LunaProbe基因分型技术,并在2型糖尿病患者群体中进行分型应用。结果:所建立的基于LunaProbe的三个变异位点的分型方法,不受限于基因变异的位置特征,可成功区分三个变异位点的不同突变型和野生型,并且在糖尿病患者人群中可达到较高的重复性和准确性。结论:LunaProbe的HRM分型方法,可成功对糖尿易感基因FTO的三个变异位点rs8050136、rs9939609和rs9930506进行人群分型,且具有敏感、经济、高通量的特性。