真菌源非核糖体肽类药物生物合成及代谢工程

真菌源非核糖体肽类(NRP)药物因其活性优异、结构多样而备受关注。至今美国食品药品监督管理局(FDA)已批准了数十种真菌NRP药物,包括环孢菌素、头孢菌素和棘白菌素等重磅药物。这些NRP药物均由非核糖体肽合成酶(NRPS)催化形成,其多样化的结构域和模块数量决定了产物骨架的多样性,从而为天然源活性NRP的开发提供了广阔的空间。此外,骨架结构上的特殊后修饰过程往往为NRP药物提供了强效的药效基团,进一步扩充了NRP结构与活性的多样性。本文综述了真菌NRP药物的研究进展,主要涵盖药物活性、生物合成途径、酶学机理和代谢工程改造等。深入了解真菌NRP药物生物合成途径不仅有助于理解相关的酶学组装机制,还有望为新型真菌NRP药物及其衍生物的深度开发提供重要的指导和参考。

双嵌入家族抗肿瘤非核糖体肽的生物合成研究进展

双嵌入家族(bisintercalator)非核糖体肽是一类由放线菌产生的C2中心对称的环状肽类化合物,能够通过其结构中两个独特的发色基团插入到DNA分子中,因此具有良好的抗菌和抗肿瘤等生物活性。这些家族化合物的结构多样性主要源于芳香杂环、氨基酸种类和数量以及修饰基团的不同。这些结构差异不仅导致其抗菌和抗肿瘤活性的强度和选择性的不同,还赋予了它们抗真菌、抗疟、抗病毒等其他活性。本文总结了双嵌入家族非核糖体肽的结构与活性和生物合成途径,展望了其未来发展方向以及面对的挑战。双嵌入家族非核糖体肽的分子结构复杂,化学合成非常具有挑战性,微生物发酵是生产此家族化合物的主要方法。近年来,双嵌入非核糖体肽类家族的生物合成途径得到了较为系统的研究,该家族主要代表性分子的肽链骨架组装、起始单元的生物合成以及后修饰过程已被基本阐明。这些研究成果不仅揭示了一系列微生物次级代谢中新颖的生物合成酶家族和酶催化机理,也为通过合成生物技术对该家族分子进行分子结构创新提供了珍贵的生物催化组件。这些生物合成的理论知识将进一步推动这一具有前景的天然产物家族的精准发现与后续的药物开发研究。

丝状真菌转录因子调控非核糖体肽合成酶介导的次级代谢产物合成研究进展

丝状真菌(Filamentous fungi)产生的次级代谢产物(Secondary Metabolites,SM)广泛应用于生物医药、生物防治及食品等领域。大多数SM的生物合成与非核糖体肽合成酶(Nonribosomal peptide synthetase,NRPS)的催化密切相关,故NRPS的表达调控对SM的生物合成至关重要。为了深入了解丝状真菌NRPS基因簇的表达调控模式,本文就通路特异性和全局性两种转录因子调控丝状真菌NRPS介导SM生成的研究进展进行了综述,以期深化对丝状真菌中转录因子调控NRPS介导的SM生成机制的认识,为丝状真菌天然产物的开发提供参考依据。

非核糖体肽合成酶体系设计和改造研究进展

自然界中,微生物合成肽类化合物一般通过核糖体途径合成核糖体肽,而非核糖体肽(nonribosomal peptide,NP)是一类不通过核糖体途径、由非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)催化合成的肽类化合物。非核糖体肽合成酶是一种模块化、线性化组装的酶,以类似流水装配线的方式发挥作用。它们产生的次生代谢物多肽通常具有非常复杂的结构,其中有许多是具有重要药理意义的天然产物。NRPS的模块化性质导致其可以通过模块重组实现产物多样化,基于这个发现,科学家们对其进行了深入研究,以期通过人为改造和重构等方式产生更多更有价值的产物。该文集中介绍近年来通过NRPS人工改造和重组等方式生产多肽的研究,为未来发现和生产新的生物活性化合物提供思路。

牛樟芝非核糖体多肽合成酶基因(AcNRPS)的克隆与鉴定

胶霉毒素属于真菌天然次生代谢产物epipolythiodioxopiperazine(ETP)家族,具有免疫抑制剂、抗真菌等多种生物活性,是由非核糖体多肽合成酶(NRPSs)催化合成。从牛樟芝(Antrodia camphorata)基因组中挖掘出非核糖体多肽合成酶基因(AcNRPS,NCBI登录号为KX430967),克隆获取其全长cDNA,并对其进行生物信息学分析和表达谱分析。结果显示AcNRPS基因cDNA全长6 687 bp;与其DNA序列比对发现AcNRPS基因含有12个内含子;其开放阅读框编码2 229个氨基酸残基,BLAST比对发现其含有2个A-C-T结构域,底物需2个氨基酸;系统发育树结果显示AcNRPS与其他合成产物为胶霉毒素的NRPS基因聚为一类,其可合成胶霉毒素类化合物;表达谱分析显示,以葡萄糖和土豆蛋白胨作为碳、氮源的培养基能够有效促进牛樟芝NRPS基因的表达。

差向异构结构域在非核糖体肽合成中的作用

差向异构结构域作为非核糖体肽合成酶体系中重要组分,将L型氨基酸异构化为D型氨基酸,赋予了非核糖体肽独特的生物活性和对蛋白酶的抵抗力。本文结合近期研究阐述了差向异构结构域的蛋白结构特征和异构化过程中的去质子化/再质子化机制,此外还对差向异构结构域在非核糖肽合成中的调控作用进行了总结,展望了非核糖体肽合成酶的未来发展趋势,希望为非核糖体肽合成酶的工程改造和新药的研发提供理论基础和依据。

非核糖体肽合成酶(NRPSs)作用机理与应用的研究进展

许多微生物能利用非核糖体肽合成酶(NRPSs)合成结构复杂、种类繁多的的生物活性肽。非核糖体肽因其独特的理化特性和药理学特性已被广泛关注,极具商业开发潜力。NRPSs由多个模块组成,模块的不同空间排列顺序决定其多肽产物的氨基酸序列特异性。NRPSs以多载体巯基化模板机理进行多肽合成,其底物特异性由腺苷酰化结构域和缩合结构域共同实现。目前,人们已经利用天然的NRPSs、某些特定结构域、将已知NRPSs的模块或特定结构域进行组合甚至杂合组合而构建成的新的NRPSs来合成目的多肽。

长枝木霉菌非核糖体肽合成酶基因启动子NP249的克隆及功能验证

Peptaibols是由真菌非核糖体肽合成酶(NRPS)合成的多肽抗菌素,能够抑制多种病原菌,促进植物生长和诱导细胞凋亡。为了深入探究木霉菌非核糖体肽类抗菌素合成的调控机制,为通过基因工程来提高Peptaibols产量提供帮助。通过设计引物,克隆长枝木霉菌非核糖体肽合成酶基因NP249的上游启动子区域,然后构建到一个具有绿色荧光蛋白基因(GFP)融合表达载体,验证基因NP249的启动子。以长枝木霉菌总DNA为模板,使用引物249-1B和249-4X,通过PCR技术扩增克隆到了NRPS的启动区域,全长1 204 bp。通过启动子NP249替代载体上GFP启动子,分别用BamHⅠ和XmaⅠ酶切pCX-62载体和启动子片段,T4连接酶连接,构建GFP融合载体pCX-62-NP249-GFP。通过限制性内切酶介导的转化技术转化(REMI)木霉菌原生质体,得到的转化子转到含潮霉素的培养基上进行筛选,得到潮霉素抗性转化子Z249,进一步通过荧光显微镜检测转化子,转化子Z249能检测到GFP荧光。克隆到的启动子能启动GFP表达,具备启动子功能。

非核糖体肽类化合物的组合生物合成策略研究进展

很多微生物能够利用非核糖体肽合酶合成结构复杂、种类繁多、生物活性多样的小分子肽类化合物。组合生物合成是对控制抗生素生物合成的基因簇进行阻断、置换、重组或异源表达等遗传操作,从而达到利用生物技术和环境友好的手段构建化合物衍生物库的目的。组合生物合成在增加天然活性化合物的数量,改良天然化合物的生物学活性,提高天然化合物的产量,开发创新药物和酶制剂等领域都具有重要应用价值。近年来,非核糖体肽的组合生物合成研究取得了重要进展。本文就非核糖体肽合酶的组合生物合成研究策略,从模块定点突变、替换、插入、删除、模块"洗牌"与异源表达等角度进行了综述。

非核糖体多肽合成酶研究进展

细菌和真菌采用非核糖体系统合成一些重要的多肽类物质 .近年来的研究表明 ,在该系统中发挥关键作用的是一类分子巨大的非核糖体多肽合成酶 .它们由顺序排列的组件构成 ,酶分子结构本身即蕴涵着多肽合成的信息 .对非核糖体多肽合成酶结构和功能的了解 。

非核糖体肽合成酶的末端硫酯酶与多肽环化

非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPSs)能以多载体巯基化模板机制合成各种结构复杂、种类繁多的次生代谢非核糖体环肽.根据环肽末端环化的方式,可分为两大类:大环内酯型和内酰胺型.负责非核糖体环肽最终环化的硫酯酶(thioesterase,TE)属于α/β水解酶超家族.该家族包括:脂酶、蛋白酶、酯酶等,其共有特征是含有保守的催化三元件(Ser-His-Asp),起到终止反应和释放产物的功能.TE具有区域定向性(regiospecific)、化学定向性(chemospecific)及立体定向性(stereospecific)的特点,在非核糖体肽(nonribosomal peptide,NRP)的合成反应中具有决定性作用,直接影响到最终环肽的生成.同时,TE由于其特有的环化和水解的双重活性,在体外的线性多肽环化中越来越受到众多学者的关注.综合国内外相关文献,本文着重从TE介导下的产物释放机制和影响因素两个方面综述非核糖体末端硫酯酶的研究进展及其应用.

多肽类生物活性物质的非核糖体合成机理

遗传信息通过信使核糖核酸、转运核糖核酸和核糖体转变成蛋白质的过程是分子生物学的基石。但是 ,许多多肽类生物活性物质是通过非核糖体途径合成的 ,只有非核糖体多肽合成酶系参与。非核糖体多肽合成酶系是一类多功能蛋白质复合体 ,能识别、激活、转运氨基酸底物并按特定顺序合成多肽。非核糖体多肽合成酶系同时具有酶和模板功能 ,因此被称为蛋白质模板。由于底物大部分是稀有氨基酸 ,经由该途径合成的多肽类生物活性物质种类繁多。了解多肽非核糖体合成机理有助于寻找多肽类生物活性物质 ,有利于通过人工操作非核糖体合成酶系生产多肽类药物。近年来的研究已经使人们初步了解了多肽非核糖体合成的机理。本文将介绍非核糖体合成酶系组成。

链霉菌GEMSM4(6)中聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的筛选及克隆

链霉菌GEMSM 4（6）的发酵产物具有抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性,同时还对酵母及丝状真菌尤其是植物病原菌,具有较强的抑制作用。本研究利用简并性引物对该链霉菌基因组中可能存在的聚酮合酶（PKS）和非核糖体多肽合成酶（NRPS）基因进行PCR扩增及序列分析,找到了3个NRPS及15个PKS基因的片段,其中PKS基因与Streptomyces violaceusniger Tu 4113的PKS基因序列同源性最高,达到91%~99%;而NRPS基因与数据库中已知的NRPS基因序列同源性仅为60%~62%。为克隆NRPS生物合成基因簇,构建了链霉菌GEMSM 4（6）的基因组细菌人工染色体（BAC）文库,通过PCR筛选得到包含有这3个NRPS基因的克隆子,为后期的异源表达及基因组发掘分析提供基础。

非核糖体肽合成酶基因腺苷酰化结构域序列克隆及分析

微生物许多非核糖体肽类次生代谢产物主要是由非核糖体肽合成酶(NRPS)催化合成。参考Gontang发布的非核糖体肽合成酶(NRPS)通用引物设计扩增NRPS腺苷酰化结构域基因序列的特异引物,从海洋链霉菌L1的基因组DNA中扩增获得一个715 bp的NRPS基因序列。测序结果及比对分析表明该片段属于NRPS腺苷酰化结构域部分序列。对其拟翻译的氨基酸序列组成成分、理化性质进行分析,显示其包含AFD class I超基因家族核心结合区,为NRPS腺苷酰化结构域(A结构域)所在区域。对氨基酸序列的二级结构预测和三级结构模拟,发现与数据库中肠菌素合酶F组分的结构相似。为后续研究A结构域的特异性及完整NRPS基因簇克隆提供了参考。

非核糖体肽合成酶结构研究进展

非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases,NRPS）是一类多功能蛋白质复合体,能识别、激活、转运氨基酸底物并按特定顺序合成非核糖体肽（NRPS）.NRPS构成天然生物活性产物的一大类,是细菌和霉菌等的次级代谢产物,具有结构多样性和重要的药用价值.目前发现的NRPS在微生物体内可能作为抗生素、铁载体、毒素、含氮物质的储存场所及调节生长等的信号分子等发挥各种功能[1],而其医药方面的开发应用主要集中于抗生素（如达托霉素）、抗癌药物（如博来霉素）、抗真菌药和免疫抑制剂（如环孢菌素A）等方面.

非核糖体肽合成酶缩合结构域基因片段克隆

从大连渤海海域筛选出1株放线菌L1,结合形态观察、生理生化实验和16S rDNA分子鉴定,确定L1属于链霉菌属球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)。根据GenBank发布的非核糖体肽合成酶(NRPS)序列设计引物,从放线菌L1的基因组DNA中扩增获得NRPS基因片段。测序结果及比对分析表明该片段属于NRPS缩合结构域部分序列。三维建模显示其结构呈V型,包含缩合结构域核心序列,与数据库已知结构相一致,可以推断该克隆片段为NRPS缩合结构域基因片段,为后续深入研究缩合结构域特异性与相关NRPS功能提供基础。

全霉素生物合成途径中的非核糖体肽合成酶HlmE的功能研究

目的:非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)是二硫吡咯酮类化合物骨架合成的关键,本研究对全霉素(holomycin)生物合成途径中的NRPS HlmE进行酶学功能研究,以期为二硫吡咯酮类化合物生物合成途径的解析奠定基础.方法:利用原核表达系统表达NRPS HlmE,并通过亲和层析方法和快速蛋白质液相层析(fast protein liquid chromatography,FPLC)纯化仪器获得目的蛋白;利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)对HlmE的功能进行研究.结果:本研究成功在体外纯化得到高纯度HlmE,HPLC检测到了腺嘌呤核苷单磷酸(adenosine monophosphate,AMP)和半胱氨酰-AMP的产生,证明了HlmE中腺苷化(adenylation,A)结构域的活性;MALDI-TOF MS法证明HlmE具有挂载底物半胱氨酸的功能.结论:本研究纯化得到的NRPS HlmE可以活化并挂载底物半胱氨酸,为进一步研究NRPS的功能以及深入研究二硫吡咯酮类化合物的生物合成途径奠定基础.

微生物非核糖体多肽的合成基因簇挖掘及其合成研究进展

非核糖体多肽因其独特的生物活性受到关注,它结构复杂、种类繁多。许多微生物能利用非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthase,NRPSs)合成这些非核糖体多肽。NRPSs是一类分子巨大的蛋白复合物,由一系列催化结构域组成,能识别、激活、转运氨基酸底物并按特定顺序合成非核糖体肽(non-ribosomal peptide,NRPs)。其模块化结构涉及的基因在基因组上成簇排列。基于基因组挖掘技术可以预测基因组上的次级代谢产物合成基因簇,并发现新的次级代谢产物。针对非核糖体多肽的生物合成基因簇的分布、挖掘、模块化结构以及合成等方面的研究进行分析,有望为理解非核糖体肽合成酶系统合成生物活性物质的机制和挖掘新型生物活性物质提供依据。

非核糖体肽合成酶硫酯酶结构域研究进展

微生物可通过非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPS)催化合成众多结构和功能多样的次级代谢产物——非核糖体肽(nonribosomal peptide,NRP)。NRPS装配线由多个模块组成,其中末端硫酯酶(thioesterase,TE)结构域由于其独特的水解和环化双重活性,对于产物释放及线性多肽的体外环化具有重要意义。本文主要对TE催化的产物释放机制以及其非常规的功能方面进行综述,为研发新的NRPs类化合物以及环肽的体外合成提供理论依据。

苏云金素合成基因簇中非核糖体肽合成酶基因thu2功能的初步分析

对苏云金素生物合成基因簇中编码非核糖体肽合成酶基因thu2进行基因缺失插入失活的研究。用温敏型质粒pHT304-TS构建基因thu2的插入缺失质粒pEMB1434,电转化苏云金芽胞杆菌菌株CT-43后,通过抗性筛选和PCR验证得到thu2基因同源双交换基因敲除突变株CT-43-22。HPLC(高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography)检测发现CT-43-22没有苏云金素特征吸收峰;用pHT304构建得到含有完整thu2基因的回补质粒pEMB1435,电转化CT-43-22后得到互补重组菌CT-43-22b,发现其恢复了苏云金素的产生。显微镜观察突变株和互补重组菌均能产生正常的晶体和芽胞。thu2的基因敲除和基因互补实验证明,thu2基因为CT-43苏云金素生物合成的必需基因,但对晶体和芽胞的形成没有影响。