非核糖体多肽合成酶研究进展

细菌和真菌采用非核糖体系统合成一些重要的多肽类物质 .近年来的研究表明 ,在该系统中发挥关键作用的是一类分子巨大的非核糖体多肽合成酶 .它们由顺序排列的组件构成 ,酶分子结构本身即蕴涵着多肽合成的信息 .对非核糖体多肽合成酶结构和功能的了解 。

链霉菌GEMSM4(6)中聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的筛选及克隆

链霉菌GEMSM 4（6）的发酵产物具有抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性,同时还对酵母及丝状真菌尤其是植物病原菌,具有较强的抑制作用。本研究利用简并性引物对该链霉菌基因组中可能存在的聚酮合酶（PKS）和非核糖体多肽合成酶（NRPS）基因进行PCR扩增及序列分析,找到了3个NRPS及15个PKS基因的片段,其中PKS基因与Streptomyces violaceusniger Tu 4113的PKS基因序列同源性最高,达到91%~99%;而NRPS基因与数据库中已知的NRPS基因序列同源性仅为60%~62%。为克隆NRPS生物合成基因簇,构建了链霉菌GEMSM 4（6）的基因组细菌人工染色体（BAC）文库,通过PCR筛选得到包含有这3个NRPS基因的克隆子,为后期的异源表达及基因组发掘分析提供基础。

牛樟芝非核糖体多肽合成酶基因(AcNRPS)的克隆与鉴定

胶霉毒素属于真菌天然次生代谢产物epipolythiodioxopiperazine(ETP)家族,具有免疫抑制剂、抗真菌等多种生物活性,是由非核糖体多肽合成酶(NRPSs)催化合成。从牛樟芝(Antrodia camphorata)基因组中挖掘出非核糖体多肽合成酶基因(AcNRPS,NCBI登录号为KX430967),克隆获取其全长cDNA,并对其进行生物信息学分析和表达谱分析。结果显示AcNRPS基因cDNA全长6 687 bp;与其DNA序列比对发现AcNRPS基因含有12个内含子;其开放阅读框编码2 229个氨基酸残基,BLAST比对发现其含有2个A-C-T结构域,底物需2个氨基酸;系统发育树结果显示AcNRPS与其他合成产物为胶霉毒素的NRPS基因聚为一类,其可合成胶霉毒素类化合物;表达谱分析显示,以葡萄糖和土豆蛋白胨作为碳、氮源的培养基能够有效促进牛樟芝NRPS基因的表达。

硬枝树花中非核糖体多肽合成酶NRPS基因的克隆与鉴定

以硬枝树花(Ramalina conduplicans)地衣型真菌为研究材料,采用简并引物扩增获得腺苷酰化结构域(A结构域),并以其为模板,通过Gene walking的方法获得非核糖体多肽合成酶(NRPSs)基因的全长,并对Rc NRPS基因进行生物信息学分析、分子系统进化分析及RT-PCR分析。Rc NRPS基因的开放阅读框总长3 150 bp,编码1 049个氨基酸残基。结构域分析显示:硬枝树花的NRPS基因含有腺苷酰化结构域(A结构域)、巯基化结构域(T结构域)、缩合结构域(C结构域)。将硬枝树花的Rc NRPS蛋白序列与曲霉属34条NRPS蛋白构建系统进化树,结果显示其为铁载体。生物信息学分析表明:NRPSs为非分泌蛋白,定位于细胞质基质中。RT-PCR分析表明:酵母粉是Rc NRPS基因诱导表达所必需的,蔗糖可有效促进该基因的诱导表达。

内生真菌HND5菌株抗香蕉枯萎病菌相关非核糖体多肽合成酶基因簇的鉴定

为明确帚枝霉属内生真菌Sarocladium brachiariae HND5菌株具体的抑菌活性物质,在全基因组测序数据的基础上,利用生物信息学对抑菌活性物质合成基因簇进行定位,通过聚类分析和系统发育树分析对基因簇合成产物进行鉴定,并通过基因缺失突变构建及代谢组分析确定具体的抑菌活性物质。结果显示,HND5菌株共含有7个非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)基因簇,聚类分析结果表明基因簇29合成产物为噬铁素,基因簇30合成产物为类环孢霉素类抗菌多肽;系统发育树结合生物信息学结果显示基因簇30合成产物与已知环孢霉素结构差异大,为一个新型非核糖体多肽;将基因簇30 NRPS基因缺失突变后,HND5菌株丧失抑菌活性;同野生型菌株相比,基因簇30 NRPS基因缺失突变体缺失一个分子量为887.54 Da的多肽类物质。表明HND5菌株的抑菌活性物质为一个分子量为887.54 Da的新型类环孢霉素非核糖体多肽,基因簇30负责该多肽的生物合成。

苹果树腐烂病菌非核糖体多肽合成酶基因VmNRPS12的功能

【目的】非核糖体多肽合成酶(NRPS)在植物病原真菌与其寄主互作过程中发挥着重要作用,明确Vm NRPS12基因在苹果树腐烂病菌致病过程中的功能,将为今后深入研究苹果树腐烂病菌NRPS作用机制提供理论依据。【方法】基于苹果树腐烂病菌全基因组数据,得到VmNRPS12基因。运用qRT-PCR技术分析VmNRPS12在侵染初期的表达水平,利用Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化获得该基因抗潮霉素的突变体,对突变体进行PCR检测及Southern blot验证得到敲除突变体,进一步通过重新导入该基因全长片段获得互补突变体,最后对野生型、敲除突变体和互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】定量分析显示该基因在侵染初期显著上调表达,且接种48 h后的表达量是对照的138.6倍。该基因的敲除突变体在营养生长及产孢方面与野生型菌株03-8相比无显著性差异,但致病力与野生型菌株03-8相比显著减弱,且互补突变体致病力近似恢复至野生型水平。【结论】VmNRPS12基因与苹果树腐烂病菌致病性相关。

聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶杂合体研究进展

非核糖体多肽合成酶(Nonribosomal peptide synthases,NRPSs)和聚酮合酶(Polyketide synthases,PKSs)是两类结构较复杂的多功能巨型酶,在非核糖体多肽类化合物(Nonribosomal peptide,NRP)和聚酮类化合物(Polyketide,PK)的合成中至关重要。该文的目的是希望可以为研究NRPS和PKS的工作者提供帮助。文章论述了NRPS和I型PKS的结构,简单介绍了两者的作用机理;另外,伴随生物信息技术和测序技术手段的发展,以及PKS和NRPS基因簇信息的不断完善,使得人们对PKS-NRPS杂合的机制有了清晰的认识,越来越多的PKS-NRPS杂合化合物被发现,而PKS-NRPS的杂合极大地丰富了组合生物合成的领域;还综述了近年来新发现的PKSNRPS杂合的化合物。资料显示许多微生物体内都有很多PKS-NRPS杂合的基因簇,然而在标准实验条件下,由于缺少一定的刺激,这些基因簇是不表达的,但如果利用一定的技术手段,也能够使这些沉默的基因簇表达,所获得的PKS-NRPS杂合化合物通常都会有抗菌或抗肿瘤或抗病毒的作用,意义重大。总的来说,PKS和NRPS是两种结构复杂、功能重要的酶,可用于研制抗生素、抗真菌剂、抗癌和抗肿瘤药物等,是当前药物领域研究的热点,希望这些新的两者杂合的化合物能够带来医药研究领域的新突破。

多肽类生物活性物质的非核糖体合成机理

遗传信息通过信使核糖核酸、转运核糖核酸和核糖体转变成蛋白质的过程是分子生物学的基石。但是 ,许多多肽类生物活性物质是通过非核糖体途径合成的 ,只有非核糖体多肽合成酶系参与。非核糖体多肽合成酶系是一类多功能蛋白质复合体 ,能识别、激活、转运氨基酸底物并按特定顺序合成多肽。非核糖体多肽合成酶系同时具有酶和模板功能 ,因此被称为蛋白质模板。由于底物大部分是稀有氨基酸 ,经由该途径合成的多肽类生物活性物质种类繁多。了解多肽非核糖体合成机理有助于寻找多肽类生物活性物质 ,有利于通过人工操作非核糖体合成酶系生产多肽类药物。近年来的研究已经使人们初步了解了多肽非核糖体合成的机理。本文将介绍非核糖体合成酶系组成。

虫生真菌非核糖体多肽活性产物生物合成潜力预测

肉座菌目虫生真菌合成的非核糖体多肽类天然产物具有抗菌、杀虫、抗癌、调节免疫等生物活性,在临床和农业等领域有重要应用价值。近年来,随着真菌基因组测序数量的迅速增加、注释和分析工具的不断进步,人们发现真菌基因组中存在大量产物未知的天然产物合成基因。准确有效地预测这些基因的功能,筛选最有潜力合成新颖天然产物的基因簇,可以提高天然产物挖掘的效率。本研究选取40株肉座菌目虫生真菌基因组,系统分析了编码非核糖体多肽合成酶的基因及基因簇。基于隐马尔可夫模型,预测了445个模块型非核糖体多肽合成酶和1243个类非核糖体多肽合成酶;通过提取腺苷酰化结构域,构建序列相似性网络,以已知功能的非核糖体多肽合成酶作为标签,利用马尔可夫聚类算法,分析了非核糖体多肽产物的主要类别,发现了可能合成线性多肽、环缩肽、脂多肽、生物碱等新型结构化合物的基因簇。研究结果不仅揭示了肉座菌目虫生真菌合成非核糖体多肽活性产物的巨大潜力,而且为通过激活沉默基因簇挖掘新产物、利用合成生物学手段改造合成途径提供参考。

mRNA指导非核糖体多肽合成

从多种生物体内分离出的天然多肽类物质常含有N-甲基化骨架和非蛋白氨基酸，这有利于增强其蛋白酶水解稳定性、对膜的通透能力以及与靶标的亲和性等。它们通常不是由核糖体合成，不需要mRNA模版，而是由复杂的多酶聚合体（即非核糖体多肽合成酶）合成，这大大增加了构建期望的多肽物质库的难度。

以mRNA为模版合成核糖体多肽

最近,来自日本东京大学的Takashi Kawakami等新发现了一种以mRNA为模板通过核糖体途径合成该类天然多肽的方法，改变了过去只能由非核糖体多肽合成酶合成多肽的单一局面。这个新的技术平台为构建N-甲基化多肽产物库提供了便利条件．在药物开发方面具有重要应用前景。

环肽的分析方法与研究

环肽是一种较线性多肽更为稳定的具有多种生理功能和医药价值的环状多肽,在形成荷尔蒙、抗生素、离子载体系统、抗真菌素、癌制剂以及毒素等方面展现出丰富多样的生物活性,具有重大的应用价值。近年来随着生物技术以及生物学与化学领域的交叉发展,不断有新的环肽被分离并鉴定出来。本文综述了自然界存在的一些环肽及环肽的分离纯化、分析方法,并且对环肽的生物合成机制和化学合成进行了概述。

基于NRPS基因筛选鉴定产生环脂肽葡萄附生细菌的研究

本研究采用平板稀释法和斜面分离纯化技术,从夏黑葡萄中筛选分离到5株附生细菌,提取菌株的基因组DNA,PCR扩增16S r DNA序列,产物纯化后进行克隆测序,利用MEGA 6.0软件对序列进行同源性比对分析,构建系统进化树后,将5株附生细菌分别鉴定为克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、克考氏菌(Kocuria marina)、嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus agaridevorans)。在此基础上,以非核糖体多肽合成酶基因(non-ribosomal peptide compounds synthetase,NRPS)为靶点,筛选到含有目的条带的菌株PTWA2,经系统发育树预测该菌株能够产生环脂肽类化合物。该菌株发酵产物经有机溶剂萃取、常压硅胶柱层析、Sephedex LH-20等分离手段纯化得到一个单体化合物,采用核磁共振和质谱方法鉴定该化合物为环脂肽Surfactin A。该研究结果为以功能基因定向筛选产生环脂肽化合物的菌株提供了新的研究方法与理论依据。

组合生物合成

天然产物是一重要的药物来源 ,同时比化学合成能提供更多的结构多样性 ,然而由于受限于传统的方法其多样性未得到进一步利用。组合生物合成就是近些年来发展起来的获取大量天然、非天然产物的方法。最近几年更是得到了很大的发展。聚酮类化合物的生物合成则是这个技术应用最为成熟的领域。本文对聚酮类物质生物合成途径研究的发展作了回顾 ,并对目前组合生物合成的研究状况作了概述。

基于NRPS功能基因筛选鉴定盐生海芦笋内生细菌的研究

本研究从盐生海芦笋中分离得到两株具有抑菌活性的内生细菌YK-7、YK-10,利用形态学观察、分子生物学方法与生理生化实验对其进行鉴定,并对其发酵产物进行了预测与验证。结果表明两株菌株分别为解淀粉芽胞杆菌亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.Plantarum)以及阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)。通过PCR扩增非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因,发现菌株YK-7含有NRPS基因片段,经系统发育树分析,预测该菌株可能产生环脂肽类化合物Surfactin,进一步对该菌株发酵产物进行电喷雾质谱(Electrospray mass,ESI-MS)分析证实了预测结果。该研究结果证实了从基因预测化合物的结构类型对于定向筛选有价值的化合物具有重要意义。

基于NRPS基因筛选与鉴定葡萄附生真菌

以非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)基因为筛选靶点,从葡萄中筛选出含有NRPS基因的附生真菌,以期发现具有抗菌作用的环肽类化合物。采用平板划线技术、斜面分离纯化技术分离葡萄附生真菌,从中筛选出一株含有NRPS基因的附生真菌(编号PTLM-1)。在此基础上,构建系统发育进化树,结合形态学方法,将该菌株鉴定为腐皮镰刀菌Fusarium solani。经过NRPS系统发育进化树分析,发现该菌株有产生抗菌环肽类化合物——环孢菌素的潜力。通过对该菌的发酵产物进行电喷雾质谱分析,进一步证实了该预测结果。该研究为定向筛选产生环肽类化合物的菌株提供了新的研究方法与理论依据。

中国被毛孢分离鉴定及其PKS、NRPS功能基因的多样性

探究中国被毛孢(Ophiocordyceps sinensis)遗传、聚酮合成酶(Polyketide synthase,PKS)、非核糖体多肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthase,NRPS)的多样性,为寻找合成生物活性物质的潜在菌株奠定基础。采用组织分离法从冬虫夏草中分离获得一株具有较强抑菌活性的真菌ZG4-23,采用多基因系统分析的方法对该菌株进行鉴定;利用兼并性引物对菌株ZG4-23的PKS基因和NRPS基因进行PCR扩增及序列测定分析,构建系统发育树,明确菌株ZG4-23的PKS基因序列和NRPS基因序列的系统进化地位。结果表明,多基因序列分析显示,菌株ZG4-23与多个中国被毛孢菌株同源性高达99%,因此确定该菌株为中国被毛孢(O.sinensis)。菌株基因组含有PKS I、NRPS基因,经比对,PKS I片段与已知Ophiocordyceps sinensis PKS序列相似度为99%,NRPS片段与Trichophyton rubrum NRPS序列相似度为76%。中国被毛孢具有较强合成生物活性次生代谢产物的潜在能力,值得进一步开发研究和应用。

海洋放线菌S.areniocola CNS-205腺苷化结构域基因的克隆、表达和纯化

海洋放线菌S.arenicola CNS-205是首次报道的专属海洋性放线菌属Salinispora的代表菌株之一.选取海洋放线菌S.arenicola CNS-205非核糖体多肽合成酶氨基酸腺苷化结构域基因sare 0357,对其进行生物信息学分析后进行原核重组质粒的构建和表达及蛋白纯化.分别构建了pET-28a-sare 0357和pGEX-KG-sare 0357重组质粒,并转化E.coli BL21(DE3)进行不同诱导条件的诱导表达,sare 0357基因均以包涵体的形式表达.收集Sare0357重组蛋白包涵体,选取6mol/L的盐酸胍对其进行变性并将变性后的重组蛋白进行镍柱纯化.得到了可溶性的Sare0357融合蛋白.

海洋放线菌Salinispora areniocola CNS-205腺苷化结构域基因sare0357的酶活测定

[目的]测定海洋放线菌S.areniocola CNS-205腺苷化结构域基因sare0357的酶活。[方法]选取海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS A domain基因sare0357,对其进行克隆表达和功能鉴定。[结果]在以Trp为底物时测定Sare0357蛋白的酶动力学参数为:Km=(0.040 33±0.003 67)mmol/L,Vmax=(2.135 05±0.029 43)μmol/(min·L),kcat=(14.233 6±0.196 2)min;Phe为底物时:Km=(0.027 65±0.001 51)mmol/L,Vmax=(1.558 06±0.009 7)μmol/(min·L),kcat=(10.387 1±0.064 6)min。[结论]丰富洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS腺苷化结构域的底物特异性和密码子领域的研究,为组合生物学和体外酶系合成NRPs提供依据。

西藏米拉山草甸土壤PKS和NRPS基因多样性

为了解西藏米拉山草甸土壤中的聚酮合成酶(PKS)基因和非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因多样性,采用直接提取土壤总DNA,PCR扩增Ⅰ型PKS基因KS域和NRPS基因A域,并在NCBI进行Blast比对,分析其系统进化发育.得到27个PKS基因KS片段,经NCBI比对,主要来自蓝细菌(Cyanobaeteria)、α-和γ-变形菌(Proteobaeteria)和不能培养的微生物,得到NPRSA片段32个,主要属于变形菌门、蓝细菌门等.