非水相青霉素酰化酶催化反应研究进展

青霉素酰化酶(penicillin acylase,PA)又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶,主要从大肠埃希菌胞内酶和巨大芽孢杆菌胞外酶获得,该酶已大规模应用于工业生产β-内酰胺类抗生素的关键中间体,并试图开发应用于半合成β-内酰胺类抗生素的工业生产。本文概述近年来PA在非水相催化中的研究进展,重点介绍提高非水相酶的稳定性的方法,如固定化方法、生物学方法和介质工程等。

深度学科交叉和高度过程集成的非水相生物催化

和化学合成相比, 生物催化具有选择性高、反应条件温和、环境友好的特性而成为生物技术中一个快速发展的领域. 但生物催化工业常受到底物溶解度低、底物/产物抑制生物催化剂活性、产物进一步降解等限制.非水相催化和原位产物去除新技术是克服上述困难的有力工具, 本文综述了其研究进展. 以甾醇边链切除的微生物转化为例, 介绍了作者最近开发的高度集成了非水相催化和原位产物去除优点的浊点两相分配生物反应器技术. 讨论了非水相生物催化工业高度过程集成和深度学科交叉的特征, 提出了发展非水相生物催化工业的若干建议.

非水相中固定化脂肪酶催化辛酸辛酯的合成

使用溶胶—凝胶法将猪胰脂肪酶包埋固定化在无机载体中。实验测定了硅氧烷前体MTr-MOS与TMOS的比例,反应体系中固定化酶的加入量,用以饱和有机溶剂的磷酸缓冲液的pH值以及有机溶剂种类对固定化脂肪酶催化辛酸辛酯合成的影响。实验结果显示,当MTrMOS与TMOS的物质的量之比为4∶1,固定化酶加入量为600 mg,磷酸缓冲液的pH值为7.5,有机溶剂选用异辛烷时,对辛酸辛酯的合成有利。

推进清洁生产技术的有效手段——均相催化多相化

综述了近年来为解决催化剂有效分离而研究开发的液/液两相催化体系,特别是结合现有工业应用实例,从开 发清洁生产工艺的角度对均相催化多相化的工业应用前景进行了评述。

《应用生物催化》特色教学内容概览

《应用生物催化》是生物化工专业的核心课程。其研究为化学、医药、食品等领域高附加值产品的生产奠定基础。生物催化的特色教学领域包括非水相体系、手性物质合成、定向进化和极端微生物等方面。应用生物催化核心教学内容的归纳与总结,将有助于学生快速掌握本学科的知识体系,并为生物化工领域的科研人员提供重要参考资料。

表面活性剂对华根霉脂肪酶有机相酯合成活性的激活

利用表面活性剂结合无机盐与华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶(RCL)共冻干,以提高RCL在有机相中的酯合成活性.结果表明,n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)可以显著激活RCL的酯合成活性.DDM激活效果的关键影响因素是DDM与RCL的摩尔比,而非DDM浓度;当二者摩尔比大于30时,RCL酯合成活性随着该比值的增大而提高.此外,添加适量无机盐可以进一步强化DDM对脂肪酶酯合成活性的激活效果.利用激活的RCL分别在有机溶剂和无溶剂体系中催化生物香料己酸乙酯和生物柴油油酸乙酯的合成,酯合成效率得到明显提高,表明该方法的有效性和适用性.

化学修饰——提高酶催化性能的重要工具

讨论了化学修饰对酶的稳定性、有机溶剂溶解性、特殊条件下的活性和选择性的影响。对常见的和近期出现的酶修饰技术,包括交联酶晶体、酶蛋白侧链功能基共价修饰、酶蛋白表面修饰、结合定点突变的化学修饰、通过酶活性位点氨基酸原子置换进行化学突变等方法作了重点阐述。

华根霉脂肪酶有机相酯合成活性的重塑

研究了具有较高酯合成活性的华根霉膜相关脂肪酶及其沉淀酶蛋白的重折叠处理过程,发现膜成分及表面活性剂可能是影响其活性的关键因素.进一步考察了影响异源表达的可溶性华根霉脂肪酶r27RCL酯合成活性重塑的关键因子及作用阶段.研究结果表明,表面活性剂对脂肪酶的酯合成活性具有关键影响,直接添加表面活性剂可使酯合成活性显著提高.在7种不同表面活性剂中,两性离子表面活性剂LPC14将r27RCL的酯合成活性提高了5. 75倍.分子动力学模拟结果表明,在有机相反应中,表面活性剂的添加使脂肪酶催化三联体之间的氢键作用力得到加强,从而提高了脂肪酶的有机相酯合成能力.

非水相酶催化技术的应用

该项目利用非水相酶催化技术开发了光学活性环氧丙醇、手性2-辛醇、鲸蜡油、类可可酯和单酰甘油酯5个酶反应新产品,并提供了适合工业化应用的酶法生产新工艺。采用具有水解(S)-环氧丙醇丁酸酯专一性的根霉脂肪酶得到光学纯度超过95％e.e.的(R)-环氧丙醇丁酸酯;开发了固定化酶和双亲分子非共价修饰酶相协同的新方法,拆分得到的(S)-2-辛醇的光学纯度达98.0％e.e.;采用无溶剂系统,在63L反应器中进行了中试放大试验,所得鲸蜡油产品含蜡量达到95％;以资源丰富、价廉的乌桕脂为原料,利用1,3-位选择性脂肪酶和有机相中酶促反应,制得类可可脂纯度超过90％;以假单胞菌脂肪酶为催化剂进行无溶剂法棕榈油甘油解反应制得单甘酯,并在15L反应器中进行了放大试验,产品中单甘酯含量为76.0％,还对单甘酯在化妆品中的应用进行了初步研究。

醛基化大分子强化介孔泡沫硅中青霉素酰化酶和胰蛋白酶的固定化

为了提高酶的亚基增强固定化酶的稳定性,在介孔泡沫硅中对固定化酶进行共价修饰.以青霉素酰化酶和胰蛋白酶为目标酶,考察醛基化修饰对固定化酶活力、负载率的影响以及在酸性缓冲溶液、亲水有机体系和离子液体中的催化稳定性,并对固定化酶进行电泳分析.结果表明:醛基化修饰的青霉素酰化酶在酸性缓冲液中6 h保留95%的残余活力,在疏水离子液体中50℃处理10 h保留近80%的残余活力;醛基化胰蛋白酶在20%乙醇中50℃保持活力不变.因此,醛基化修饰能稳定酶的亚基,在创建酶催化的微环境的同时,又能提高酶在极端环境下的稳定性.

有机溶剂对酵母细胞膜完整性的作用机制研究

在非水相催化和涉及有机溶剂环境的微生物技术中,有机溶剂对细胞的毒性使相关的研究和应用受到制约。酵母作为最典型的生物催化剂之一,本文系统阐述了有机溶剂对酵母细胞膜完整性的影响,探讨了有机溶剂对酵母的作用机制。

糖基转移酶GTBM的克隆、表达及其在芹菜素糖基化修饰中的应用

以耐有机溶剂菌库中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)YZ08为模板,设计相关引物克隆出糖基转移酶基因bmgt,构建工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bmgt,诱导表达获得了糖基转移酶GT_(BM)。His-tag标签法纯化得到电泳纯的糖基转移酶GT_(BM),考察pH、温度、金属离子对酶活的影响及GT_(BM)对二甲基亚砜(DMSO)的耐受性。建立糖基转移酶GT_(BM)蔗糖合成酶SuSy双酶耦联催化体系,优化pH、温度、DMSO浓度、蔗糖浓度、酶液添加量等参数对双酶耦联糖基化芹菜素的影响。结果发现:GT_(BM)有着较好的DMSO耐受性,在pH 7.5、温度35℃、10%(体积分数)DMSO、20 mmol/L蔗糖、0.1 mmol/L尿苷二磷酸(UDP)、60 mU/mL GT_(BM)和20 mU/mL蔗糖合成酶SuSy条件下,芹菜素糖基化反应的转化率在4 h达到95%,且产物单一。GT_(BM)有着较好的DMSO耐受性、区域选择性和较高的糖基化芹菜素产率。

微流控芯片不互溶相酶催化反应显微拉曼检测

生物酶的研究对生命现象本质的揭示具有极其重要的意义。通常生物酶反应的研究是在水溶液体系中进行,与其在生物体内所处的水/有机两相界面微环境不相同。通过微流控芯片可获取稳定的水/有机相界面,并利用显微拉曼光谱仪进行微区扫描实现微流控芯片两相酶反应的检测。定量考察了氰根离子在微流控芯片中水相与苯胺相之间扩散行为,并检测了辣根过氧化物酶催化联苯胺与对甲基苯胺的聚合反应。结果表明,在芯片上,非极性分子联苯胺的酶催化反应产物结构组成较极性分子对甲基苯胺更为复杂,而在普通烧杯中的反应则观察不到这个现象。

固定化糖苷酶在糖苷类化合物合成中的应用

糖苷类化合物在医药、食品、表面活性剂和化妆品等领域应用广泛,通过糖苷酶催化糖苷类化合物合成具有原料成本低、反应条件温和等优点。糖苷酶催化过程可分为逆水解反应和转糖苷反应两大类,但反应体系中的水会限制反应的进行,而适当降低体系中的水活度可以有效提高糖苷酶的催化效率。但游离的糖苷酶在低水活度时容易失活,限制了糖苷酶在低水环境下的应用。固定化酶技术通过载体和酶的相互结合能够有效提高酶结构的稳定性,使得糖苷酶能够在低水环境下甚至有机溶剂体系中保持酶活,从而实现糖苷酶在低水活度环境下的应用,提升糖苷合成效率。从糖苷酶催化性质出发,文中归纳了近30年来糖苷酶固定化的相关研究,其中包括单一或综合的固定化技术,以及近些年发展的结合基因工程的固定化技术,为糖苷酶的固定化及糖苷合成提供了可借鉴的思路和方法。