以非洲猪瘟病毒DNA聚合酶X为靶点的海洋药物计算机虚拟筛选

目的从天然产物中高效快速地筛选出一批有效针对非洲猪瘟病毒的药物苗头化合物,为寻找能抑制猪瘟蔓延的生物饲料提供线索。方法利用计算机辅助药物设计技术,以非洲猪瘟病毒DNA聚合酶X的DNA结合区为靶点,进行虚拟筛选,在陆生和海洋天然产物中,化合物通过文献搜索和数据库查询明确部分天然产物的来源。结果从陆生天然产物库中筛选出16个苗头化合物,其中有5个源自中国;在海洋化合物数据库MarinChem3D中得到了59个苗头化合物,其中有8个源自中国。结论中国境内分布有13种潜在的具抑制非洲猪瘟效果的天然产物,其中大部分来源于海洋生物。

非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对ASFVB646L(p72)基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。

非洲猪瘟病毒防污染双重荧光定量PCR检测方法的建立

荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术在非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测中发挥重要作用,然而该方法也存在一些局限性。一方面由于检测环境中易产生气溶胶污染,经常导致qPCR检测产生假阳性结果。另一方面,临床上已发现MGF基因缺失的变异株,现有的检测方法将无法满足野毒株与变异株鉴别检测的需求。为了解决qPCR易产生假阳性,ASFV核酸检测靶标基因过分单一的问题,建立了ASFV的防污染双重qPCR检测方法。该检测方法根据C962R基因和MGF-505-2R基因的保守序列设计引物和探针,并在反应体系中加入UNG酶达到防污染的目的,建立了ASFV的防污染双重qPCR检测方法。结果表明,利用该方法对C962R基因和MGF-505-2R的基因标准品进行检测,该检测方法具有较好的鉴别诊断效果。该检测方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.99;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL的ASFV基因标准品;特异性强,与猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(Hoemophilus parasuis)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)及猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)均无交叉反应;重复性较好,变异系数小于1.75%,使用该检测方法对194份临床组织样品检测,与商品化非洲猪瘟病毒抗原检测试剂盒比较,检测结果均为阴性,符合率为100%。该方法预期可用于ASFV野毒株与MGF-505-2R基因缺失株的鉴别诊断,为深入开展分子流行病学调查提供技术储备。

非洲猪瘟病毒的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法的建立

为了建立一种特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(ASFV)快速检测方法,试验针对ASFV B646基因保守片段设计并合成特异性crRNA(crRNA1、crRNA2、crRNA3),并根据crRNA所在的基因序列区域设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物(RPA1-F/RPA1-R、RPA2F/RPA2-R),通过筛选最佳RPA引物-crRNA序列组合和crRNA浓度建立ASFV的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法,在评估该方法的特异性和灵敏度后对ASFV阳性临床样本进行验证。结果表明:最佳RPA引物-crRNA序列组合为RPA2-crRNA3,最佳crRNA浓度为5μmol/L;该方法仅能检测出ASFV,不能检测出猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2),特异性良好;最低检测病毒浓度为5.8 copies/μL,灵敏度较高;应用该方法对20份ASFV阳性临床样本进行检测,结果均为阳性,符合率为100%。说明成功建立了ASFV的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法,该方法特异性好、灵敏度高,可用于ASFV的现场快速检测。

非洲猪瘟病毒蛋白MGF-360-10L抑制STAT1/2信号通路的机制研究

非洲猪瘟(ASF)是由核质巨DNA病毒-非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪、野猪等所引起的急性、烈性、出血性传染病。高致病性ASFV引起的急性感染死亡率达100%,给全球养殖业造成了巨大经济损失。ASFV基因组庞大,结构复杂,编码多种蛋白,目前缺少有效的疫苗和治疗药物。近期发表于《m Bio》的研究论文,探究了MGF-360-10L抑制宿主天然免疫信号通路的具体机制。前期通过双荧光素酶报告系统筛选发现MGF-360-10L能够抑制STAT1/2信号通路,但不影响IFN-γ诱导的IRF1启动子的激活。

非洲猪瘟病毒PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白基因vp73的序列,设计一对特异性检测引物,扩增片段251 bp,建立了检测ASFV的PCR方法。与OIE推荐使用的2组PCR引物进行比对试验,结果表明,3组引物的检测特异性相当,但本研究设计的引物灵敏度至少高出100倍。表明所建立的PCR方法能敏感、快速地检测非洲猪瘟病毒。

非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)通用型高通量检测技术,利用高度保守的非结构DNA聚合酶G1211R基因,制备质粒标准品,建立实时荧光LAMP方法,出现典型的S形核酸扩增曲线,扩增产物具有特异的熔解曲线。G1211R基因质粒标准品在1.81×10~5拷贝数/μL^1.81×10~9拷贝数/μL对数值与Ct值之间的线性关系良好。以ASFV E70株病毒核酸为模板,LAMP检测灵敏度达到21pg,优于荧光定量PCR方法。重复性试验LAMP检测批内和批间变异系数均小于5%。LAMP方法检测ASFV特异性良好,与猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及昆虫核酸无交叉反应。以ASFV Arm 07株制备各种临床模拟样品,检出阳性率达到17.31%。检测方法的建立,可为非洲猪瘟防控提供新的技术手段,有利于不同基因型毒株检测和出入境快速筛查。

非洲猪瘟病毒RPA等温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的非洲猪瘟病毒（ASFV）分子检测方法,基于ASFV P72基因保守序列,设计并合成引物,建立了一种ASFV重组酶聚合酶扩增（RPA）等温检测方法。结果表明,所建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min,即可实现对目的片段的有效扩增;以包含ASFV P72基因的ORF质粒为模板,RPA的检测限达到10～2 copies,同世界动物卫生组织（OIE）推荐的实时荧光PCR方法检测限一致,但比OIE推荐方法的检测限高10倍;RPA仅特异性扩增ASFV P72基因,对FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组c DNA或DNA没有扩增。本研究所建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠,为非洲猪瘟的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。

乙型肝炎病毒cccDNA与HBx蛋白在肝细胞性肝癌中表达的关系及意义

目的:探讨肝细胞性肝癌中乙型肝炎病毒(HBV)cccDNA与HBx蛋白表达的关系及其意义.方法:取42例肝细胞性肝癌患者的癌和癌旁组织,采用SABC法检测组织中的HBx蛋白;采用RT-PCR法检测组织中的HBV cccDNA水平.结果:HBx蛋白在癌及癌旁组织中的阳性例数分别为31例(73.8%)和35例(83.3%),无显著性差异;癌旁组织中cccDNA水平较癌组织中的高,但是统计学检验无显著性差异;癌组织和癌旁组织中HBx蛋白(+)者的cccDNA水平均明显高于HBx蛋白(-)者(P<0.05).HBx蛋白表达与cccDNA水平呈正相关(r=0.778,P<0.01).结论:HBx蛋白的表达与cccDNA水平明显相关,他们相互作用、相互影响并在肝癌的发生发展中起重要作用.

非洲猪瘟病毒检测技术概述

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种具有急性、烈性、高度接触性的传染病,致死率高达100%,传播范围十分广泛,由于目前尚无有效的疫苗对这种病毒进行免疫预防,必须进行检测、扑杀和隔离,才能阻断病毒的传播,因此亟需建立简便、快速、有效的核酸检测方法。通过介绍当前使用的非洲猪瘟病毒的检测方法,归纳出各种方法的优缺点,并对非洲猪瘟病毒检测技术的发展方向进行阐述。

非洲猪瘟病毒PCR检测方法的建立

非洲猪瘟给全球养猪业造成了严重危害,需要建立更加敏感的PCR检测方法。根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的VP72基因序列,设计PCR引物,建立了ASFV PCR检测方法。以合成的VP72基因片段为阳性对照,进行敏感性试验和特异性试验。同时与世界动物卫生组织(OIE)推荐的PCR引物进行对比试验。结果显示,建立的方法可用于ASFV检测,且对其他病毒检测时无交叉反应,特异性良好;敏感性可达到10-8,比OIE推荐的方法高10倍,为ASFV检测提供了一种新的PCR方法。

中国台湾科研人员解密非洲猪瘟病毒

据中国台湾“中央社”消息，《美国化学学会期刊》刊登一项中国台湾的研究，研究团队以核磁共振法，找出非洲猪瘟病毒DNA聚合酶如何突破黄金配对准则，有助发现致病原因和治疗方式。

一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒,包括ASFV#反应液、DNA酶混合液、ASFV#内标、ASFV#阳性对照、ASFV#阴性对照、核酸释放剂以及ASFV#定量参考品,所述ASFV#反应液包括:引物:ASF03F03和ASF03R03;内标引物:IPC05F01和IPC05R01;探针ASF03P和内标探针IPC05P;所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段。本发明还公开了一种制备上述非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的方法以及使用其的检测方法。

猪瘟病毒分子生物学诊断的研究进展

猪瘟是由猪瘟病毒引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病,严重危害我国养猪业。尽管中国很早就研制成功了猪瘟兔化弱毒疫苗,但近年来猪瘟的流行和发病特点发生了很大的变化,很多地区和猪场不断出现非典型猪瘟、温和型猪瘟,给该病的诊断带来了困难。近年来,猪瘟病毒分子生物学诊断方法的研究进展迅速,为猪瘟的快速、准确诊断起到了重要的作用。从聚合酶链式反应技术、核酸探针技术、DNA芯片技术等方面对猪瘟病毒的分子生物学诊断方法进行了综述。

非洲猪瘟实时荧光RPA诊断方法建立及应用

【目的】非洲猪瘟(African swine fever,ASF)自2018年首次暴发于我国沈阳后,迅速扩散至全国,对我国养猪业造成了沉重打击。研究针对其病原非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)建立一种快速核酸检测技术,为及时发现、准确处理ASF疫情提供一种快速诊断方法。【方法】针对ASFV保守的B646L(p72)基因,设计并筛选合适的引物、探针组合,利用基于重组酶-聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)的实时荧光RPA方法,对反应体系、反应条件、样品处理步骤等进行优化;利用质控品,对检测方法的特异性和灵敏度进行评价。对1 009份临床样品进行检测,并利用OIE推荐的实时荧光定量PCR方法(qPCR)和病毒分离,进一步验证该方法的检测结果。【结果】筛选得到一套合适的引物、探针,建立了针对ASFV p72基因的实时荧光RPA检测方法,优化后的反应体系总体积为25μL,在实时荧光定量PCR仪器上,最适反应条件为39℃10 s,39℃20 s,40个循环,扩增反应时间约20 min;室温裂解法可取代传统核酸提取方法作为本检测的样品处理方法;使用优化后的条件,可在30 min内实现样品处理、核酸扩增和结果判定的整个过程,特异性评价结果显示本方法对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒1型/2型(PCV1/2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)样品扩增结果均为阴性;敏感性评价结果显示本方法对基因I型、II型、IX型ASFV的模拟样品均可检出,对II型ASFV阳性模拟血样品可检测至10拷贝/μL,对已知阳性临床组织样品可检至1:103.0稀释度,与OIE推荐的实时荧光定量PCR(qPCR)方法的检测灵敏度一致。通过对1 009份临床样品进行检测,实时荧光RPA诊断方法检出17份阳性,其结果与qPCR方法完全一致;病毒分离获得17份阳性培养物。【结论】建立的实时荧光RPA核酸检测方法操作简便,耗时短,具有较高的灵敏度和特异性,为临床提供了一种新型、简单、特异、快速诊断非洲猪瘟的方法。

GeXP分析仪：7种猪病原体的多重PCR检测

基于GenolneLab Gene Expression Profiler（GeXP）分析仪，一种新的高通聩方法被提出，即利用多重PCR（聚合酶链式反应）可灾现同时对猪7种病原体的检测。该方法可检测的病原体包括：伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）和日本脑炎病毒（JEV）。

重组酶聚合酶扩增技术快速检测猪肉及其制品中ASFV、PDCoV和SVA

目的建立非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和A型塞内卡病毒(SVA)多重重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法。方法以重组质粒为模板进行RPA检测,并优化温度、时间、引物探针配比等反应条件,建立多重RPA检测方法,应用于实际样本的检测;与实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)结果对比,评价所建立方法的准确率。结果本方法可在20 min内实现对3种病毒的同时检测,特异性良好;对ASFV、PDCoV、SVA灵敏度分别为940、770、570 copies/μL;用于实际核酸样本检测,准确率分别为93.33%、100.00%、100.00%。结论本文建立的多重RPA方法快速、便捷,适合猪肉及其制品中ASFV、PDCoV、SVA的现场初筛。

非洲猪瘟病毒LFD-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)B646L基因保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速检测法。结果表明,该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等病原核酸无交叉反应;最低可以检测到1.57×10^2copies/μL重组质粒pUC-B646L;检测时间短,其中RPA扩增20 min,LFD检测10~20 min。应用该法及OIE推荐的荧光PCR法对24个模拟样品进行检测,检测结果一致。对50份已知的临床样品核酸进行检测,阳性符合率为73.3%。上述结果表明,本研究建立的LFD-RPA快速检测方法操作简便,为ASFV现场快速检测提供了技术支持。