针对非洲猪瘟病毒K205R基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swin fever virus,ASFV),本文根据我国流行毒株ASFV SY18(GenBank ID:MH766894.1)已公布的K205R基因序列设计并合成特异性引物及探针,建立针对K205R基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法。经过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测试验分析显示,本文建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法Ct值与标准品在1×10^(11)~1×10^(2)copies/μL范围内具有很好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-2.797,检测下限为10^(2)copies/μL,与其他能引起相似临床症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.53774%,重复性好。本方法适用于临床样品及本实验室构建的表达ASFV K205R基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴定及检测,对ASFV快速检测及ASF早期诊断有重要意义。

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法

试验旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)的荧光定量PCR检测方法,根据ASFV P72基因核苷酸序列,通过基因克隆技术在质粒载体中克隆一段ASFV P72基因片段,设计一对特异性引物以及探针,通过带有基因序列的重组质粒绘制曲线,构建了一种ASFV荧光定量PCR检测手段。结果显示,该方法具有较高的敏感度,标准曲线线性关系较好,相关系数达到0.9998,重复性较佳,变异系数小;且以其他疾病核酸为模板均未出现扩增曲线,特异性较好。研究表明,该荧光定量PCR方法能够为ASFV的检测提供帮助。

如何规避非洲猪瘟荧光定量PCR检测实验中的操作问题

非洲猪瘟荧光定量PCR检测作为一种实验室快速检测技术,已被广泛应用于非洲猪瘟病原诊断中。荧光定量PCR法是一种准确、快速的检测方法,在根除、检测非洲猪瘟的过程中具有较高的应用价值。虽然,该实验室检测技术、试验试剂等非常成熟,但因检测人员操作不当,造成检测结果不清晰和假阳性复检等常有发生,实验结果无效会浪费大量实验时间和实验材料。本文仅以密云区动物疫病预防控制中心实验室的非洲猪瘟荧光定量PCR检测实验中出现的问题进行分析,提出改善措施,解决实际问题,为其他拥有相同问题的地区实验室提供参考。

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR的建立及4种检测试剂盒的比较

为评估目前常用商品化非洲猪瘟荧光定量PCR检测试剂盒,参考OIE推荐的非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光定量PCR方法合成引物和探针,建立非洲猪瘟病毒qPCR检测方法(OIE-qPCR);并与市面4种ASFV检测试剂盒进行了比较。以人工合成的ASFV p72基因TA克隆重组质粒为阳性标准品,OIE-qPCR可以检测到10~10^(2) copies;而4种ASFV荧光定量PCR检测试剂盒中,进口试剂盒TF-qPCR能检测到10 copies,进口试剂盒ID-qPCR和国产试剂盒QD-qPCR能检测到10~10^(2) copies,而国产试剂盒LY-qPCR能检测到10^(2) copies。对健康猪组织样及临床模拟样品的检测结果显示:OIE-qPCR与4种检测试剂盒之间的符合率为92.60%~99.03%。其中,阳性样品C T值的相关系数为0.988~0.997(Perason法),表明各试剂盒之间相关性良好;但在检测病毒核酸含量较低的样品时,各试剂盒结果之间存在一定差异,其中,TF-qPCR试剂盒显示更高的阳性检出率,ID-qPCR试剂盒和LY-qPCR试剂盒次之。本研究为临床选用非洲猪瘟病毒快速检测试剂盒提供了依据。

部分商品化非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的比对

为获得商品化非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光PCR检测试剂盒的敏感性、特异性、一致性和最低检测限等试验数据,以世界动物卫生组织(OIE)推荐引物探针为金标准,以62份已灭活的ASFV阳性田间样品、32份阴性田间样品和P72基因核酸标准物质为检测对象,对农业农村部公布许可的其中17个厂家生产的商品化ASFV荧光PCR检测试剂盒开展了试验特性方面的比对研究。结果显示,17个厂家生产试剂盒的敏感性最低为77.4%,最高为96.8%,特异性最低为87.5%,最高为96.8%,均未达到100%,且有一定差别;12个厂家的试剂盒与OIE推荐引物探针检测结果一致性较好(Kappa值≥0.75),其余5个厂家的试剂盒与其一致性一般(0.4<Kappa值<0.75);17个厂家的试剂盒均可检测到的最低稀释度为5.9×10^(3)×2^(-3)拷贝/μL,但不同厂家试剂盒的最低检测限有所差别,其中5个试剂盒可检测到的最低稀释度为5.9×10^(3)×2^(-3)拷贝/μL,2个试剂盒为5.9×10^(3)×2^(-4)拷贝/μL,6个试剂盒为5.9×10^(3)×2^(-5)拷贝/μL,3个试剂盒为5.9×10^(3)×2^(-6)拷贝/μL,1个试剂盒至少为5.9×10^(3)×2^(-7),且大部分国产试剂盒的最低检测限比进口试剂盒低。本研究为ASFV荧光PCR检测试剂盒的筛选和比对提供了参考数据。

三种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒和两种核酸提取方法的比对

为评价不同荧光PCR检测试剂盒对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的检测效果,以及不同核酸提取方法对ASFV的提取差异,选取ASFV B646L基因标准物质作为模板参照,通过荧光PCR检测对标准曲线、最低检出限(LOD)、特异性、检测时间等进行比较,分析3个厂家商品化ASFV荧光PCR检测试剂盒(A、B、C)的综合性能;选取磁珠法和柱式法两种核酸提取方式,对标准物质核酸提取后进行ASFV荧光PCR扩增,以Ct值大小评价试剂的提取效果。结果显示:3种ASFV荧光PCR试剂盒决定系数(R~2)分别为0.985、0.996、0.985,且特异性较好;3种ASFV荧光PCR试剂盒LOD介于10~10copies/μL,A试剂盒反应循环数最多且反应时间最长(105 min),LOD为10copies/μL。全自动核酸提取工作站与手工核酸提取Ct值无统计学差异(P> 0.1),批内变异系数(CV)在1.5%以内。结果表明:3种荧光PCR检测试剂盒的综合性能较为理想,A试剂盒更适用于临床含毒量低的样品检测;两种核酸提取方法均可有效提取ASFV B646L基因质粒标准物质。本试验为科学、合理选择ASFV检测和提取试剂提供了数据参考。

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法,本研究根据GenBank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法,验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示:本研究所建立的检测方法特异性强,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;灵敏度高,能检出10拷贝阳性质粒DNA;重复性好,组内和组间重复试验变异系数均小于1.5%。本研究为非洲猪瘟快速诊断提供了有力技术支撑,为进一步开发ASFV多重荧光PCR检测技术奠定了坚实的基础。

6种非洲猪瘟荧光PCR试剂盒对比试验

对5个厂家的6种非洲猪瘟荧光PCR试剂盒检测的敏感性和一致性进行综合比较,选取已知阳性的核酸样品作为待测样品进行梯度稀释,每组设置三个平行对照,使用A1、A2、B、C、D、E6种试剂盒,按照各厂家试剂盒说明书对所有样品进行非洲猪瘟荧光PCR检测及结果判定,并从检出ct值的样品数量、检出核酸最低拷贝浓度、检出ct值的平均值和检出ct值的离散度四个维度来综合评估对6种试剂盒的敏感性和一致性。结果显示:检测灵敏度方面,由高至低的排名为试剂盒D>试剂盒C>试剂盒A2>试剂盒E>试剂盒B>试剂盒A1;检测一致性方面,试剂盒D>试剂盒C>试剂盒A2>试剂盒E>试剂盒B=试剂盒A1。综合6种试剂盒的敏感性和一致性来看,试剂盒D的灵敏度和一致性最好,试剂盒C稍低于试剂盒D,但差距很小,几乎在同一水平,试剂盒A2灵敏度和一致性次之,其余三种试剂盒E>试剂盒B>试剂盒A1。

基于P72、MGF和CD2v基因的非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测方法的建立

非洲猪瘟在临床上出现多种毒株,主要分为野毒株和基因变异毒株。因其在临床上造成不同程度的危害,有必要建立一种方法进行正确诊断和健康监测。为实现野毒株和基因变异毒株的鉴别诊断,研究根据GenBank中的ASFV中国流行株(登录号:MK333180.1)的P72、CD2v、MGF基因保守序列设计引物,建立一种可以同时检测上述三种基因的三重荧光定量PCR方法。三重荧光定量PCR方法对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒2型(PRV)和猪圆环病毒(PCV2)检测均无交叉反应,表现出较强的特异性。敏感性检测显示针对P72、CD2v和MGF重组质粒标准品的最低检测下限为103~102 copies/mL。在重复性试验中,大部分组间变异系数均小于2%或接近2%,具有较好的重复性。试验表明,三重荧光定量PCR方法可用来鉴别野毒株和基因变异毒株。

核酸提取试剂盒对饲料中牛羊源性成分检测的影响

实时荧光聚合酶链反应法(荧光PCR法)是目前饲料中牛羊源性成分的定性检测中常用方法之一。为了熟练操作和掌握这个方法,使得实验室工作人员在做饲料中牛羊源性成分定性这类检测时能有一个清晰的认识,通过核酸提取试剂盒的选取及平行实验比对,对此进行了阐释。

基于非洲猪瘟病毒标准物质的荧光PCR检测试剂盒初步评价

为探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)标准物质作为试剂盒评价体系的可行性,比较了市场上5种主流品牌ASFV荧光PCR检测试剂盒的检测性能。使用ASFV P72基因核酸标准物质作为模板,根据5种试剂盒说明书分别进行相应的荧光定量PCR检测,结合扩增曲线、Ct值,分析不同试剂盒的敏感性、可重复性以及所需反应时间。结果显示:5种试剂盒的阴性、阳性对照均成立,最低检测限均为5.9×10^(-1)拷贝/μL;4个厂家的试剂盒线性关系R2>0.98,其中最优的R^(2)=0.994,离散度最小;各试剂盒的实际反应耗时与理论反应耗时均有一定差异(0.20~0.96 h)。结果表明,各生产厂家使用P72基因作为靶基因研制的ASFV荧光PCR检测试剂盒都可以使用ASFV标准物质作为评价体系,来评判试剂盒的检测性能。本试验为各实验室不同样品检测的ASFV荧光PCR检测试剂盒选择提供了一种可用的评价方法。

6种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较

为了比较市场上国产及进口非洲猪瘟病毒(ASFV)ELISA抗体检测试剂盒的产品质量和使用效果,本试验对B、C、D三种进口试剂盒和A、E、F三种国产试剂盒进行敏感性、特异性和重复性比较。结果显示,试剂盒B、D、E、F分析敏感性均为1∶512;试剂盒C分析敏感性为1∶256;试剂盒A分析敏感性为1∶128;诊断敏感性比较结果为试剂盒B>试剂盒D、F>试剂盒E>试剂盒C>试剂盒A;6种试剂盒对7份特异性质控血清的检测结果均为阴性,表明6种试剂盒均具有排除潜在交叉反应的病原抗体的能力;诊断特异性比较结果为试剂盒A、C、D>试剂盒F>试剂盒E>试剂盒B;批内重复性结果显示,6种试剂盒的批内变异系数(CV%)均在15%以内。结果表明,非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测国产试剂盒与进口试剂盒的敏感性、特异性和批内重复性相差无几,国产试剂盒的兴起解决了以往过度依赖昂贵的进口试剂盒的问题,国产化替代进程在不断加速。

不同厂家非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒比对

为评价不同厂家非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的效果,选择当前市场上6个厂家的商品化试剂盒,检测不同类型样品,结合统计学方法对试剂盒的特异性、敏感性和重复性等性能指标进行比对分析。结果显示:6个厂家的试剂盒ROC曲线下区域面积(AUC)为0.826~0.951,Youden指数为0.76~0.90,说明试剂盒的排他性和包含性等特异性指标总体表现较好;最低检出限(LOD)等敏感性数据显示,6个厂家试剂盒的LOD为10^(-1)~10^(2) copies/μL,说明各试剂盒的敏感性均较理想;用高、低浓度样品对试剂盒分别进行批内、批间重复性试验,发现高浓度样品的批内、批间变异系数(CV)为0.10%~1.28%,说明重复性较好,仅有2个厂家的试剂盒在检测低浓度样品时表现较好,批内CV为2.25%~6.12%,批间CV为2.93%和4.93%,说明不同试剂盒检测低浓度样品时稳定性较差。本研究为商品化荧光PCR检测试剂盒的评价提供了参考。

不同非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒在检测猪肉及猪肉制品中的比较

为了解不同非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒在检测猪肉及猪肉制品中的特征,采用国内外6种商品化非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒,分别对同一样本开展稳定性试验,对相同非洲猪瘟强阳性、中阳性及弱阳性样本开展敏感性试验。结果显示:6种试剂盒扩增稳定性良好;对强阳性样本,所有商品化试剂盒均能检出;对中阳性及弱阳性样本,特别是弱阳性样本,不同试剂盒的检出情况不尽相同。因此在实际应用中,应根据具体需求选择合适检测试剂盒。本试验为一线工作者选择使用不同商品化非洲猪瘟检测试剂盒提供了一定参考。

不同荧光PCR试剂盒检测非洲猪瘟病毒的比对与分析

为全面认识不同试剂盒检测非洲猪瘟病毒的特性。本文采用商品化的四种非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒以ASF阳性对照为样品进行试验与研究。结果表明:同一种试剂扩增不同的阳性样本,其S型曲线轮廓基本相同。相同样本分别用不同试剂扩增,其S型曲线呈现出不同的轮廓特征。就S型曲线轮廓美观度而言,试剂B和C较理想。就相对荧光强度而言,A>C>B>D差异极显著(P<0.01),A试剂盒反应液中Taq酶、dNTP、离子等最充足,其次为C、B、D。B试剂反应所需要时间最短,最省时,其次为C、D、A。在实际应用中,应根据具体需求选择试剂盒。

检测猪瘟病毒的商业化荧光PCR试剂盒比对验证

为了比较猪瘟病毒6种荧光PCR检测试剂盒的使用效果,本研究采用标准毒株、疫苗与猪瘟阳性组织3类样品,对这些试剂盒的敏感性、特异性、重复性及有效期符合率进行比较。结果显示,试剂盒差异较大,仅有国外试剂盒和2家国产试剂盒与预期的结果一致,其对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型以及阴性猪样品的核酸无交叉反应,重复性与再现性均为理想,在有效期内检测结果没有发生变化。本研究开展检测猪瘟病毒试剂盒验证试验,这将为猪瘟的病原学诊断及实验室开展其它试剂盒验证提供参考。

青岛立见“非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒”获得农业农村部兽药产品批准文号

根据《兽药管理条例》和《兽药产品批准文号管理办法》,对国内突发重大动物疫病防控急需的兽药产品,农业农村部可以核发临时兽药产品批准文号。经农业农村部特定程序审查,由青岛立见诊断技术发展中心生产的“非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒”获得农业农村部兽药产品批准文号:兽药临字154028864。

基层非洲猪瘟荧光定量PCR检测技术研究

随着现代化养猪业的快速发展,非洲猪瘟已成为全球养猪业最大的威胁之一。我国将非洲猪瘟列为重点防范的一类动物疫病,实行严格的防控措施,包括加强检测和监测、加强动物隔离和消毒、实行扑杀等紧急措施。在基层工作中,为了更快速、准确地检测非洲猪瘟病毒,多采用荧光定量PCR的检测方法。本文将围绕这个主题进行论述。

一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒,包括ASFV#反应液、DNA酶混合液、ASFV#内标、ASFV#阳性对照、ASFV#阴性对照、核酸释放剂以及ASFV#定量参考品,所述ASFV#反应液包括:引物:ASF03F03和ASF03R03;内标引物:IPC05F01和IPC05R01;探针ASF03P和内标探针IPC05P;所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段。本发明还公开了一种制备上述非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的方法以及使用其的检测方法。

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测技术的研究与评价

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)K205R基因序列设计合成引物及TaqMan探针,通过优化引物浓度、退火温度和Mg2+浓度,建立基于K205R基因的ASFV实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法。对在猪肝脏组织DNA中掺入重组质粒制备的模拟样品进行扩增来确定所建方法的实际检测效率,并将OIE推荐的基于p72的qPCR调整后作为评价该方法检测效果的对照。试验结果表明,基于K205R基因的检测方法在检测模拟样品时扩增效率要优于基于p72的方法,而且敏感性和特异性强,适用于非洲猪瘟的快速检测、监测。