非洲绿猴TRIM3基因的克隆与序列分析

对非洲绿猴三基序结合蛋白3的基因(TRIM3基因)进行克隆并进行序列分析。扩增非洲绿猴TRIM3基因编码区域(CDS),应用在线软件进行生物信息学分析。非洲绿猴TRIM3基因CDS序列全长2235 bp,编码744个氨基酸。核苷酸相似性分析结果显示,非洲绿猴与猕猴相似性最高,相似性为99.5%,与石龟的相似性为75.3%。生物信息学分析显示,非洲绿猴三基序结合蛋白3分子质量为80.93 ku,理论等电点为8.03,不稳定系数为40.01,是不稳定蛋白。亲水性分析显示,三基序结合蛋白3为亲水性蛋白,不是分泌蛋白,预测该蛋白有22个磷酸化位点。三基序结合蛋白3二级结构以延伸链为主,占38.84%。

非洲绿猴肾细胞(Vero)无血清细胞库的建立

目的建立Vero细胞无血清细胞库。方法采用序贯适应和直接适应方法,将Vero细胞从有血清培养适应到无血清培养,建立Vero细胞无血清细胞主库和工作库,采用STR图谱并结合染色体计数对Vero细胞进行鉴别,并对Vero细胞无血清细胞库进行致瘤性和病毒外源因子检定。结果两种方法均能使Vero细胞适应到无血清培养,其中直接适应法可大大缩短适应代次,因此选择其作为建立Vero细胞无血清细胞库的方法。Vero细胞无血清主库和工作库的STR图谱与日本细胞库公布的Vero细胞STR图谱完全一致,Vero细胞库无外源因子污染,无致瘤性。结论Vero细胞无血清细胞库可用作生物制品生产用候选细胞基质。

非洲绿猴肾细胞外源绿色荧光蛋白基因表达的RNA干扰

非洲绿猴肾细胞 (Vero)是多种病毒的适应细胞。本研究将外源的绿色荧光蛋白 (GFP)基因转染到Vero-E6中 ,并利用体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA(siGFP)对其表达进行干扰。结果显示 :siGFP能有效阻断外源的绿色荧光蛋白基因在Vero -E6细胞中的表达 ,而不相关的siRNA则对绿荧光蛋白基因的表达没有影响。这为利用RNAi技术在Vero -E6细胞中 ,抑制外源基因的表达以及通过RNAi技术进行抗病毒的研究奠定了一定的基础。

锁阳多糖对H_2O_2诱导非洲绿猴肾上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的研究锁阳多糖对过氧化氢(H2O2)诱导非洲绿猴肾上皮(Verda Reno,简称VERO)细胞损伤的保护作用。方法建立H2O2致VERO细胞氧化损伤模型,MTT法检测细胞存活率;通过荧光光度法检测caspase-3活性;利用荧光探针DCFH-DA对荧光染色的胞内活性氧(ROS)检测其荧光强度;化学比色法测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,以及细胞培养液中丙二醛(MDA)水平。结果锁阳多糖能明显改善H2O2诱导的VERO细胞的氧化损伤,与模型组相比,锁阳多糖组可使细胞存活率升高,细胞内的ROS的积累量显著降低(P<0.01),caspase-3活性下降(P<0.05),同时细胞内的SOD和GSH-Px活性明显增加(P<0.01),细胞培养液中的MDA水平明显降低(P<0.01)。结论锁阳多糖能对H2O2诱导的VERO细胞的氧化损伤保护提示其具有潜在的防治肾脏相关疾病的作用。

1,2-二氯乙烷对非洲绿猴肾细胞损伤机理的离体试验研究

目的 了解 1,2 二氯乙烷对非洲绿猴肾细胞的损伤及其机理。方法 采用 0 5、1 0、2 0mmol/L 3个剂量 1,2 二氯乙烷处理非洲绿猴肾细胞 (Vero细胞 ) 2 4h,并运用显微荧光术测定处理后的Vero细胞内活性氧 (ROS)含量及游离Ca2 + 浓度 ,用比色法测定Vero细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力。设立对照组。结果 接触 1 0、2 0mmol/L 1,2 二氯乙烷的Vero细胞内游离Ca2 + 浓度及其上清液LDH活力均高于对照组 (P <0 0 1) ,而 0 5mmol/L染毒组的Vero细胞内游离Ca2 + 浓度及其上清液LDH活力与对照组比较差异均无显著性 (P >0 0 5 )。各剂量组的Vero细胞内ROS含量与对照组比较差异均无显著性 (P >0 0 5 )。结论 较高浓度的 1,2 二氯乙烷能损伤Vero细胞 ,其损伤的可能途径是通过增加细胞内游离Ca2 + 浓度。

氯仿对非洲绿猴肾细胞损伤机理的研究

目的 实验研究氯仿染毒 2 4h对非洲绿猴肾细胞的损伤及其机理。方法 运用显微荧光术测定了非洲绿猴肾细胞 (Vero细胞 )内活性氧 (ROS)含量及游离Ca2 + 浓度 ,同时 ,测定Vero细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力用于检查Vero细胞受损情况。结果 接触浓度为 4 0mmol L氯仿的Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 +浓度与对照组比较无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,同时 ,表示Vero细胞受损指标 (LDH活力 )也无显著性差异 (P >0 0 5 ) ;而接触浓度为 8 0mmol L、12 0mmol L氯仿的Vero细胞内ROS含量显著高于对照组 (P <0 0 1) ,其Vero细胞受损也显著增加 (P <0 0 5、P <0 0 1)。结论 较高浓度的氯仿能损伤Vero细胞 。

黄曲霉毒素B1对非洲绿猴肾细胞的毒性效应及作用机制研究

目的探讨黄曲霉毒素B1(AFB1)对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)的毒性效应及其作用机制。方法体外培养Vero E6细胞,不同浓度AFB1处理细胞后,采用CCK-8法检测细胞存活率;检测乳酸盐脱氢酶(LDH)释放率;利用Annexin V/PI双染、DAPI染色研究细胞死亡机制。结果 AFB1对Vero E6细胞有显著毒性损伤效应,200μmol/L AFB1处理Vero E6细胞48h后,细胞存活率不到10%。细胞LDH释放率随着AFB1浓度增加而显著升高。Annexin V/PI染色检测到细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻。DAPI染色检测到细胞核碎裂。结论 AFB1对Vero E6细胞具有明显的毒性损伤作用,其可能通过凋亡的机制引起细胞死亡。

非洲绿猴层黏连蛋白受体的克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达非洲绿猴层黏连蛋白受体(LR),对该受体蛋白进行纯化、复性研究。方法:采用RT-PCR从Vero-E6细胞总RNA中扩增非洲绿猴LR的cDNA序列,克隆到pGEM-TEasy载体上;将LR编码区插入到表达载体pET22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG进行诱导表达;用镍亲和柱进行亲和纯化;采用分部透析方法进行复性。结果:非洲绿猴LR基因序列与人LR的基因编码序列有16个碱基差异,但蛋白序列只有1个氨基酸的改变。LR蛋白以包涵体形式表达。采用分部透析方法可使部分蛋白得到复性。结论:克隆了首个非洲绿猴的相对分子质量为37000的LR的基因,与人LR基因序列有16个碱基差异,但其中15处都为同义突变,所以二者的蛋白质序列只有1个氨基酸改变,即293位D→E,提示LR在进化中具有很大的保守性。

非洲绿猴在艾滋病研究中的应用进展

人类在人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV-1）感染后，通常经过一段潜伏期，进展为艾滋病（acquired immunodeficiency syndromes，AIDS）。非洲绿猴（African green monkeys，AGM）是SIV（simian immunodeficiency virus，SIV）的天然宿主，虽然体内的病毒水平与HIV感染者相似，但不表现出艾滋病症状。因此，探索AGM控制病毒复制和疾病进展的分子机制，可以很好地促进对HIV感染致病机理的认识和AIDS疫苗与治疗方法的研究。本文简要介绍AGM在艾滋病研究中的应用和最新研究进展，为艾滋病动物模型的研究提供更多参考。

非洲绿猴血液学和血清生化指标的测定及分析

目的检测50只健康非洲绿猴血液学、血清生化指标,分析不同性别、不同年龄段(青幼年组:1~3岁,成年组:4~6岁)非洲绿猴的血液学、血清生化指标的差异。方法应用全自动血细胞分析仪及血液生化分析仪分别测定清醒状态下健康非洲绿猴血液学及血清生化指标。结果血液学指标中青幼年组与成年组差异显著的指标有红细胞数(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞压积(HCT)、中性粒细胞百分比(NEUT%)、淋巴细胞百分比(LYMPH%)、单核粒细胞百分比(MONO%)、嗜碱性粒细胞百分比(BASO%)(P<0.05)。青幼年组中雌猴与雄猴差异显著的指标有白细胞数(WBC)、RBC、HGB、HCT、NEUT%、LYMPH%、MONO%(P<0.05),成年组中雌猴与雄猴差异显著的指标有HCT(P<0.05),其它指标差异不显著。血清生化指标中青幼年组与成年组差异显著的指标有白蛋白(ALB)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酐(CREA)(P<0.05),青幼年组雌猴与雄猴差异显著的指标有CREA(P<0.05),成年组雌猴与雄猴差异显著的指标有总蛋白(TP)、胆固醇(CHOL)(P<0.05),其它指标差异不显著。结论本文初步建立了非洲绿猴的常规生物学数据,为评价其生物学特性及相关应用提供一定的数据基础,可供参考。

非洲绿猴肾细胞株AGMr(HindⅢ)-1高度重复顺序的克隆及初步应用

从非洲绿猴肾细胞株分离高度重复顺序AGMr（HindⅢ）－1基因，以pUC18质粒为载体构建重组质粒pUC18／AGMr（HindⅢ）－1，转化E．coliJM83。酶切分析、SouthernBlot分析和序列分析均证明克隆成功，但所用的第165代Vero细胞株与另一非洲绿猴肾BSC－1细胞株的序列相比较，172个碱基中有6个位点突变。用该重组质粒作探针，对Vero细胞培养的狂犬疫苗作SouthernBlot分析表明，未经纯化的半成品中残余细胞DNA长度约400～5000bp。斑点杂交分析表明，杂交特异性良好，残余细胞DNA最小检出量约4pg。提示AGMr（HindⅢ）－1高度重复顺序可特异地应用于Vero细胞残余DNA检测。

氧氟沙星与Cu^(2+)复合物对非洲绿猴肾细胞(Vero)的毒性效应

抗生素氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)与重金属铜离子(Cu^(2+))复合污染对离体培养的非洲绿猴肾细胞(Vero)的生长抑制作用及毒性效应,是值得关注的热点问题。通过模拟试验,研究了抗生素OFL与Cu^(2+)及其复合物对非洲绿猴肾活体细胞(Vero)的毒性效应。在正常体细胞环境下培养非洲绿猴肾细胞(Vero)3 d,加入OFL浓度为0.63、1.25、2.5、5、10 mg·L^(-1),加入Cu^(2+)浓度为2.75、6.88mg·L^(-1),反应24 h,并通过MTT法检测OFL与Cu^(2+)及其复合物对非洲绿猴肾细胞生长的抑制率。结果表明:OFL与Cu^(2+)及其复合物会导致细胞形态变化,细胞破碎,贴壁率降低。随着Cu^(2+)浓度增加,Vero细胞生长抑制率逐渐上升;OFL对Vero细胞生长有显著的影响。在2.75 mg·L^(-1)Cu^(2+)浓度时,OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞的抑制率在30%到36%之间;当OFL浓度为2.5、5、10 mg·L^(-1)时,OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞的抑制率与OFL、Cu^(2+)单一抑制率之和有显著差异,但随OFL浓度的变化没有显著差异;在6.88 mg·L^(-1)Cu^(2+)浓度处理时,OFL浓度为1.25、2.5 mg·L^(-1)时,OFL与Cu^(2+)复合物对细胞抑制率的实测值与OFL、Cu^(2+)单一抑制率之和之间没有显著差异;而当OFL浓度为0.63、5、10 mg·L^(-1)时,OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞抑制率的实测值显著低于OFL、Cu^(2+)单一抑制率之和;OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞的抑制率随着OFL浓度的增加而增加。OFL与Cu^(2+)的复合物会对Vero细胞产生毒性效应,并表现为抑制细胞生长,对细胞产生了复合污染;OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞生长的抑制率小于OFL与Cu^(2+)单一对细胞生长抑制率之和,OFL与Cu^(2+)对细胞生长的毒性具有拮抗作用。

受损伤非洲绿猴肾细胞调控CaOx晶体的成核与生长

目的是研究H2O2对非洲绿猴肾细胞(VERO)的氧化损伤作用及损伤后细胞对草酸钙(CaOxa)晶体成核与生长的诱导作用。方法:采用CCK-8法检测H2O2对VERO的增值抑制作用,建立VERO细胞的氧化损伤模型,并用倒置显微镜和SEM观测细胞的形态变化及晶体生长情况。结果:0.1mM的H2O2作用VERO细胞20min即能引起较为明显的损伤,且随作用时间的延长而损伤程度加重。结论:H2O2能明显地损伤细胞,降低细胞的存活率,且在0～60min的时间范围和0～1.0mM的浓度范围内呈时间依赖性和浓度依赖性;CaOxa晶体的成核与生长受VERO细胞的调控,表现为诱导形成的晶体形貌和尺寸方面的不同。

非洲绿猴肾上皮细胞损伤及诱导草酸钙晶体

采用非洲绿猴肾上皮细胞系（Vero）为研究对象，建立了其H2O2氧化性损伤模型，研究了正常与损伤不同程度的Vero细胞诱导草酸钙（CaOxa）结晶的差异，采用CCK-8法检测了细胞的活力；采用流式细胞术检测了细胞的线粒体膜电位的变化；采用扫描电子显微镜（SEM）观察了Vero细胞的形态变化和所诱导的晶体．结果表明，损伤程度不同的Vero细胞在过饱和的CaOxa溶液中，诱导CaOxa晶体的情况存在差异，细胞损伤程度越严重，就会加剧诱导CaOxa晶体的生长．

非洲绿猴IFITM3基因的克隆及其组织特异性表达差异

目的为研究非洲绿猴(African green monkeys,AGM)干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon-induced transmembrane protein,IFITMs)的功能,以及其发挥抗病毒作用的机制及作用方式,从非洲绿猴的不同组织器官中克隆了IFITM3基因,并对基因的表达特性进行了分析。方法用RT-PCR方法从非洲绿猴的心、肝、肺、肾、脑等组织器官中克隆IFITM3的全长c DNA。用DNAMAN软件比较不同物种来源IFITM3 c DNA的核苷酸差异,对AGM IFITM3的遗传多样性进行分析;用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测了非洲绿猴各组织器官中IFITM3基因的表达情况;用病理学和免疫组化方法,检测非洲绿猴不同组织器官中IFITM3蛋白的表达差异。结果非洲绿猴的淋巴细胞、皮肤、心脏、脑、肝、肾、肺和脾中均检测到IFITM3的表达,所获IFITM3 c DNA大约为440 bp(442~448 bp),在基因进化方面与猕猴的相似性达到93%。软件预测AGM IFITM3蛋白含有高度保守的五个跨膜结构域和特异性位点。Real-time PCR结果显示,非洲绿猴IFITM3基因在脾中的表达量最高,在脑中表达量最低;而免疫组化结果显示,皮脂腺、脾和淋巴细胞中IFITM3蛋白含量最高,而脑组织、肺部等蛋白含量较低。结论基于IFITM3在非洲绿猴组织器官中的广泛存在,并在其重要免疫器官脾和淋巴中的高丰度表达,推测IFITM3在非洲绿猴健全的免疫系统和较强的免疫能力建成过程中发挥着重要作用,与非洲绿猴对重要人兽共患病毒感染的免疫力和适应性有重要关系。

非洲绿猴肾细胞传代培养中细胞消化液的优化试验

通过比较0.25%胰蛋白酶和改良的细胞消化液(0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶)对非洲绿猴肾(Vero)传代细胞系的消化分散效果,确定最适合实际生产需要的细胞消化液。结果表明,用改良的细胞消化液消化Vero传代细胞系,消化时间短,消化效果好,优于0.25%胰蛋白酶的消化效果。

非洲绿猴和食蟹猴主要肠道细菌的实时定量PCR检测及分析

目的非洲绿猴具有不同于食蟹猴和恒河猴等猕猴的生物学特征,如脂质代谢、自发性高血压、SIV感染不引起获得性免疫缺陷综合症(AIDS)等,本研究拟对食蟹猴和非洲绿猴肠道细菌的相对含量进行比较研究。方法随机选取SIV抗体阴性的成年食蟹猴和非洲绿猴各12只,排除肥胖和疾病个体,收集其新鲜粪便样本,按200 mg每份等分后进行液氮速冻,-80℃保存。其中1份进行肠道细菌的实时定量PCR分析。结果与食蟹猴相比,非洲绿猴双歧杆菌、乳酸菌以及肠杆菌相对含量显著偏低(P<0.05),而普氏菌以及丁酸盐产生菌——普拉梭菌和真细菌相对含量更高(P<0.05)。结论非洲绿猴产丁酸盐的细菌相对含量更高,反映出其肠道免疫细胞稳态和黏膜完整性具有不同于食蟹猴的进化适应特征,为深入研究非洲绿猴对SIV感染不致病的相关机制奠定了基础。

抗菌肽葛佬素在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达及其活性的初步分析

目的 观察自行设计的葛佬素cDNA在非洲绿猴肾细胞株COS 7中的表达及其表达产物的抗菌作用。 方法 分析同种族蛋白质AttacinAcDNA序列各种遗传密码子的出现频度 ,结合已知的葛佬素蛋白质序列 ,设计、合成其cDNA序列。经测序验证后 ,将葛佬素基因插入真核细胞表达载体pCDSI中 ,构建载体pBZHG。随后以脂质体为载体 ,对COS 7细胞进行质粒pBZHG和空载体pCDSI的转染 ,72h后收集细胞培养上清液 ,进行杀菌活性的检测 (以正常COS 7细胞培养上清作对照 )。 结果 人工设计的葛佬素cDNA序列在COS 7中得到表达。与转染空载体的细胞和正常细胞比较 ,转染pBZHG的COS 7细胞培养上清对大肠杆菌J5具有杀菌活性。 结论 笔者所设计的葛佬素cDNA序列是正确的 ,由此可为深入研究葛佬素的抗菌及抗内毒素作用提供实验依据。