非洲绿猴肾细胞(Vero)无血清细胞库的建立

目的建立Vero细胞无血清细胞库。方法采用序贯适应和直接适应方法,将Vero细胞从有血清培养适应到无血清培养,建立Vero细胞无血清细胞主库和工作库,采用STR图谱并结合染色体计数对Vero细胞进行鉴别,并对Vero细胞无血清细胞库进行致瘤性和病毒外源因子检定。结果两种方法均能使Vero细胞适应到无血清培养,其中直接适应法可大大缩短适应代次,因此选择其作为建立Vero细胞无血清细胞库的方法。Vero细胞无血清主库和工作库的STR图谱与日本细胞库公布的Vero细胞STR图谱完全一致,Vero细胞库无外源因子污染,无致瘤性。结论Vero细胞无血清细胞库可用作生物制品生产用候选细胞基质。

黄曲霉毒素B1对非洲绿猴肾细胞的毒性效应及作用机制研究

目的探讨黄曲霉毒素B1(AFB1)对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)的毒性效应及其作用机制。方法体外培养Vero E6细胞,不同浓度AFB1处理细胞后,采用CCK-8法检测细胞存活率;检测乳酸盐脱氢酶(LDH)释放率;利用Annexin V/PI双染、DAPI染色研究细胞死亡机制。结果 AFB1对Vero E6细胞有显著毒性损伤效应,200μmol/L AFB1处理Vero E6细胞48h后,细胞存活率不到10%。细胞LDH释放率随着AFB1浓度增加而显著升高。Annexin V/PI染色检测到细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻。DAPI染色检测到细胞核碎裂。结论 AFB1对Vero E6细胞具有明显的毒性损伤作用,其可能通过凋亡的机制引起细胞死亡。

氧氟沙星与Cu^(2+)复合物对非洲绿猴肾细胞(Vero)的毒性效应

抗生素氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)与重金属铜离子(Cu^(2+))复合污染对离体培养的非洲绿猴肾细胞(Vero)的生长抑制作用及毒性效应,是值得关注的热点问题。通过模拟试验,研究了抗生素OFL与Cu^(2+)及其复合物对非洲绿猴肾活体细胞(Vero)的毒性效应。在正常体细胞环境下培养非洲绿猴肾细胞(Vero)3 d,加入OFL浓度为0.63、1.25、2.5、5、10 mg·L^(-1),加入Cu^(2+)浓度为2.75、6.88mg·L^(-1),反应24 h,并通过MTT法检测OFL与Cu^(2+)及其复合物对非洲绿猴肾细胞生长的抑制率。结果表明:OFL与Cu^(2+)及其复合物会导致细胞形态变化,细胞破碎,贴壁率降低。随着Cu^(2+)浓度增加,Vero细胞生长抑制率逐渐上升;OFL对Vero细胞生长有显著的影响。在2.75 mg·L^(-1)Cu^(2+)浓度时,OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞的抑制率在30%到36%之间;当OFL浓度为2.5、5、10 mg·L^(-1)时,OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞的抑制率与OFL、Cu^(2+)单一抑制率之和有显著差异,但随OFL浓度的变化没有显著差异;在6.88 mg·L^(-1)Cu^(2+)浓度处理时,OFL浓度为1.25、2.5 mg·L^(-1)时,OFL与Cu^(2+)复合物对细胞抑制率的实测值与OFL、Cu^(2+)单一抑制率之和之间没有显著差异;而当OFL浓度为0.63、5、10 mg·L^(-1)时,OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞抑制率的实测值显著低于OFL、Cu^(2+)单一抑制率之和;OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞的抑制率随着OFL浓度的增加而增加。OFL与Cu^(2+)的复合物会对Vero细胞产生毒性效应,并表现为抑制细胞生长,对细胞产生了复合污染;OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞生长的抑制率小于OFL与Cu^(2+)单一对细胞生长抑制率之和,OFL与Cu^(2+)对细胞生长的毒性具有拮抗作用。

受损伤非洲绿猴肾细胞调控CaOx晶体的成核与生长

目的是研究H2O2对非洲绿猴肾细胞(VERO)的氧化损伤作用及损伤后细胞对草酸钙(CaOxa)晶体成核与生长的诱导作用。方法:采用CCK-8法检测H2O2对VERO的增值抑制作用,建立VERO细胞的氧化损伤模型,并用倒置显微镜和SEM观测细胞的形态变化及晶体生长情况。结果:0.1mM的H2O2作用VERO细胞20min即能引起较为明显的损伤,且随作用时间的延长而损伤程度加重。结论:H2O2能明显地损伤细胞,降低细胞的存活率,且在0～60min的时间范围和0～1.0mM的浓度范围内呈时间依赖性和浓度依赖性;CaOxa晶体的成核与生长受VERO细胞的调控,表现为诱导形成的晶体形貌和尺寸方面的不同。

非洲绿猴肾细胞传代培养中细胞消化液的优化试验

通过比较0.25%胰蛋白酶和改良的细胞消化液(0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶)对非洲绿猴肾(Vero)传代细胞系的消化分散效果,确定最适合实际生产需要的细胞消化液。结果表明,用改良的细胞消化液消化Vero传代细胞系,消化时间短,消化效果好,优于0.25%胰蛋白酶的消化效果。

流行性乙型脑炎灭活疫苗(非洲绿猴肾细胞)和减毒活疫苗不同接种方案的安全性观察分析

目的对流行性乙型脑炎(乙脑)灭活疫苗(非洲绿猴肾细胞)[Japanese Encephalitis(JE)Inactivated Vaccine(Vero Cell),JEV-I(Vero)]和减毒活疫苗(JE Attenuated Live Vaccine,JEV-L)不同接种方案的安全性进行评价。方法对2453名8月龄、1074名2岁儿童随机分组,分别接种JEV-I(Vero)和JEV-L,观察接种后30min内、72h内和30d内的不良反应,并对JEV-I(Vero)和JEV-L进行比较。结果接种JEV-I(Vero)和JEV-L后,不良反应主要表现为轻(37.1～37.5℃)、中度(37.6～39.0℃)发热,局部反应主要为红肿,未观察到严重的或危及生命的不良反应。8月龄儿童30min内即时反应轻、中度合并发热率,JEV-I(Vero)(第1剂)和JEV-L分别为5.4%和6.4%;72h内分别为16.1%和14.1%;JEV-I(Vero)(第1剂)和JEV-L72h内重度(>39.0℃)发热率分别为0.4%和0.1%。2岁儿童30min内即时反应轻、中度合并发热率,JEV-I(Vero)和JEV-L分别为6.8%和7.7%;72h内分别为18.2%和19.0%;JEV-L72h内重度发热率为0.2%。JEV-I(Vero)和JEV-L不良反应发生率基本一致,30d内不良反应发生率与72h内不良反应发生率基本一致,差异无统计学意义。结论 8月龄儿童接种JEV-I(Vero)和JEV-L均有良好的安全性;曾在8月龄接种过JEV-L的2岁儿童,加强免疫JEV-I(Vero)或JEV-L也有良好的安全性。从安全性的角度,JEV-I(Vero)和JEV-L均可在预防控制JE中使用。

冻干流行性乙型脑炎灭活疫苗(非洲绿猴肾细胞)和减毒活疫苗序贯免疫的安全性评价

目的观察接种冻干流行性乙型脑炎(乙脑)灭活疫苗(非洲绿猴肾细胞)[Japanese Encephalitis Vaccine(Vero Cell),Inactivated,Freeze-dried;JEV-I]后的临床反应,以及和乙脑减毒活疫苗(Japanese Encephalitis Attenuated Live Vaccine;JEV-L)序贯免疫程序的安全性。方法以9月龄和2岁健康儿童为观察对象,分三种组合接种JEV,采取主动和被动监测相结合的方式观察接种后30d内的临床反应。结果 JEV-I和JEV-L的不良反应发生率分别为9.72%和9.59%,差异无统计学意义(χ2=0.024,P=0.876)。不良反应以Ⅰ级反应为主,占82.25%;需要治疗的发热反应占0.83%,未出现严重不良反应。三种免疫组合的不良反应发生率分别为10.50%、8.11%、9.59%,差异无统计学意义(χ2=4.267,P=0.118)。结论 JEV-I和JEV-L的不良反应发生率差异无统计学意义,JEV-I和JEV-L序贯免疫有良好的安全性。

神经生长因子对非洲绿猴肾细胞狂犬病病毒的抑制作用

目的建立狂犬病病毒(rabiesvirus,RV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)模型,将神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)作用Vero细胞,探讨NGF对RV的抑制作用。方法首先测定RV病毒50%组织细胞感染量(TCID);设立NGF组,RV组和空白对照组,应用MTT法分析NGF(1.0～1000BU/ml)对感染RV病毒50Vero细胞的存活率,并观察致细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)。结果 RVTCID为157.5TCID/ml,未见NGF5050的细胞毒性作用。MTT法结果表明,NGF促进Vero细胞增殖,增大细胞存活率,抑制嗜神经病毒(P<0.05),具有浓度依赖性(r=0.914)。结论 NGF对Vero细胞狂犬病嗜神经病毒具有抑制作用。

顺铂诱导非洲绿猴肾细胞凋亡模型的建立

目的:建立常见凋亡诱导剂顺铂(Cisplatin)诱导非洲绿猴肾细胞(Vero)凋亡的模型,为进一步研究抗凋亡基因在细胞凋亡中的分子机理打下基础。方法:分别以不同浓度的顺铂处理Vero细胞48h,用噻唑蓝(MTT)比色法、Gimesa染色、流式细胞术检测,观察处理后细胞的生长活力和凋亡情况。结果:以未处理的细胞作为对照组,1、2、3、4、5μg/mL的顺铂处理的Vero细胞生存率分别为(79.02±6.10)%、(68.84±4.42)%、(56.66±4.07)%、(46.83±3.76)%、(29.04±5.93)%(P<0.01);经顺铂诱导后细胞形态学发生明显改变,出现膜小泡和凋亡小体形成等凋亡细胞特征;流式细胞仪检测,0、1、2、3、4、5μg/mL的顺铂处理的Vero细胞后凋亡率分别为1.66%±0.19%、16.65%±1.26%、24.82%±1.03%、36.22%±1.04%、48.49%±1.24%、43.34%±1.17%(P<0.01)。结论:本实验成功建立顺铂诱导非洲绿猴肾细胞凋亡模型,将有助于进一步探讨目的基因在Vero细胞凋亡作用的的分子机制。

应用硫酸鱼精蛋白处理蔗糖密度梯度超速离心高度纯化流行性乙型脑炎灭活疫苗(非洲绿猴肾细胞)

目的通过离心试验,制备出一种高纯度的流行性乙型脑炎(乙脑)灭活纯化疫苗(非洲绿猴肾细胞)[Purified Inactivated Japanese Encephalitis Vaccine(Vero Cell),JEV]。方法生物反应器培养的Vero细胞乙脑病毒液,超滤浓缩、甲醛灭活后,应用硫酸鱼精蛋白处理,再经过高速离心,蔗糖密度梯度超速离心纯化,超滤除糖,配制成JEV(Vero细胞)。结果经检测,疫苗中Vero细胞脱氧核糖核酸残留量≤10pg(皮克,Picogram)/剂,蛋白含量≤1μg(微克)/剂,宿主蛋白残留量≤30ng(纳克,Nanogram)/ml,并获得较高的抗原回收率。结论经过优化硫酸鱼精蛋白处理和蔗糖密度梯度超速离心纯化,制得了高纯度的JEV(Vero细胞)。

几种中药体外抗猪流行性腹泻病毒活性的研究

为探究蒲公英、板蓝根、泽泻、葛根、黄芩5种中药水提物体外抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的效果,本研究先将不同浓度中药液分别2倍倍比稀释后加入非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中,观察各药物对细胞生长状态的影响来确定各药物的最大安全浓度。结果显示,蒲公英、板蓝根、泽泻、葛根、黄芩的最大安全浓度分别为3.91 mg/m L、1.95 mg/m L、1.95 mg/m L、0.98 mg/m L、0.98 mg/m L。以药物最大安全浓度为初始浓度,2倍倍比稀释各药物,共6个浓度,采用先加药物后加病毒(阻断作用),先加病毒后加药物(抑制作用)、药物和病毒同时加入(杀灭作用)3种不同加药的方式,加入已铺满单层Vero细胞的96孔细胞培养板中,72 h后加入CCK-8溶液1 h后测定各孔的OD_(450nm)值,评估阻断作用、抑制作用、杀灭作用下各药物对PEDV抑制率最高的浓度。结果显示,5种药物在阻断作用、抑制作用、杀灭作用下对PEDV抑制率最高的浓度分别为3.91 mg/m L、1.95 mg/m L、1.95 mg/m L、0.98 mg/m L以及0.98 mg/m L。以上述对PEDV抑制率最高的药物浓度为试验浓度,重复上述3种加药方式,72 h后加入CCK-8溶液1 h后测定各孔的OD_(450nm)值,计算3种作用方式下各药物对PEDV的抑制率,筛选出对PEDV抑制率最高的药物。结果显示,各中药均可在体外抑制PEDV的感染,阻断作用下黄芩对PEDV的抑制率最高达138.10%,抑制作用下蒲公英对PEDV的抑制率最高达149.90%,杀灭作用下葛根对PEDV的抑制率最高达102.90%,且蒲公英和黄芩在3种作用方式下对PEDV的抑制率均高于80%。以上结果表明蒲公英和黄芩体外抗PEDV感染的效果最好,本研究首次证实5种中药对体外抗PEDV感染的效果,为中药治疗PED提供了参考依据。

非鸡胚源细胞对传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定

采用非洲绿猴肾细胞（Ｖｅｒｏ）直接从传染性法氏囊病（ＩＢＤ）死亡小鸡的法氏囊组织中分离到Ｘ毒株和Ｎ毒株，经电镜形态学观察和多项生物学特性试验的结果表明。

细胞基质流感疫苗的研究

流行性感冒(influenza,简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,疫苗接种仍是最有效的防御措施之一。传统制备人用流感疫苗是使用鸡胚,但由于其生产周期长、操作繁琐等缺点,研究人员积极研发了细胞培养生产流感疫苗,以达到省时、高效的目的。目前,犬肾细胞(madin-darby canine kidney cells, MDCK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)和人胚胎成视网膜细胞(PER.C6)已获得药物监管机构的许可,并应用于临床研究。现就鸡胚及三种细胞培养生产的流感疫苗作一简要概述。

N端标记GFP-TFF3蛋白在非洲绿猴肾成纤维细胞表达和定位

目的构建pEGFP-N1-TFF3融合蛋白表达载体,并检测其在非洲绿猴肾成纤维细胞(COS7细胞)内的表达和定位。方法提取HT29细胞的mRNA,反转录为cDNA;以此为模板PCR扩增hTFF3(286bp-462bp)基因;通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切位点将hTFF3基因定向插入真核表达载体pEGFP-N1中;将构建的重组质粒测序成功后,转染至人肾细胞(HEK293细胞)中,荧光显微镜观察GFP-TFF3融合蛋白的表达,并提取蛋白进行Western Blot检测;利用激光扫描共聚焦显微镜观察GFP-TFF3融合蛋白在COS7细胞内的定位情况。结果酶切及测序结果证明hTFF3基因成功克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,Western Blot检测结果显示其融合蛋白分子量约为34kDa,激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示GFP-TFF3融合蛋白在COS7细胞内定位以细胞核为主,在细胞质内少量表达。结论成功构建了pEGFP-N1-TFF3真核表达载体,GFP-TFF3蛋白定位于COS7的细胞核和细胞质中。

2型单纯疱疹病毒毒力蛋白ICP34.5的真核表达及其对Ve-ro细胞活性的影响

目的:在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)毒力蛋白感染细胞多肽34.5(ICP34.5),并检测其对Vero细胞活性的影响。方法:PCR扩增HSV-2的ICP34.5基因,连接至pEGFP-C2载体,并对重组真核表达载体pEGFP-ICP34.5进行双酶切测序验证;将重组子瞬时转染Vero细胞,RT-PCR检测其在mRNA水平的表达,荧光倒置显微镜观察融合蛋白的表达,MTT法检测细胞活性。结果:经双酶切和测序验证表明pEGFP-ICP34.5构建成功,转染细胞后经RT-PCR验证有目的基因的转录,荧光显微镜下观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达,MTT法检测结果证实重组质粒可以抵消空质粒对细胞的损伤作用。结论:构建了pEGFP-ICP34.5真核表达载体,其能在Vero细胞中高效表达,并能抵消空质粒对细胞的损伤作用。

病毒疫苗制备用不同核型VERO细胞系在裸鼠体内致癌/致瘤性的系统实验研究(英文)

生产疫苗用细胞系可能具有致瘤性 ,一些常用的细胞系需要检查不同代次有无致癌性。在建立传代细胞种子库与工作库基础上 ,对研制生产病毒活疫苗所用 8株VERO细胞系在 2 19只裸鼠进行了致癌 (瘤 )实验。本研究结果表明 ,VERO细胞染色体核型可发生变异 ,亚四倍体JA株与超二倍体KA株具有强的致癌性 ,不能用于致弱活病毒疫苗制备 ,但可替代HeLa细胞系用作恶性肿瘤阳性对照细胞。筛出无致瘤性的YB、JC、M和JB株亚二倍体VERO细胞系 ,可替代BHK 2 1细胞用于狂犬病减毒活疫苗制备。VERO细胞系染色体遗传相对稳定 ,不同代次变化不大。研究发现细胞染色体遗传特征决定致瘤性质并具有种属特异性 ,不同核型细胞致瘤性不同 ,细胞染色体数目变异大小和致癌性成正相关 ,通过体内外交替选育可在裸鼠体内快速选育成功高变异率肿瘤细胞系。高变异率HeLa或VERO细胞系移植于裸鼠可能产生恶性横纹肌样瘤。因此 ,应当强调疫苗生产用细胞系致瘤性评价的重要性。

不同培养条件对vero细胞的增殖及其检测病毒含量的影响

本试验旨在研究不同培养条件下,非洲绿猴肾细胞(vero细胞)的增殖及其检测病毒含量的情况,为生物制品的研发提供一定理论依据。本试验选用Cell Counting Kit-8(CCK-8)和半数组织细胞感染剂量(TCID50)方法检测了不同培养条件对vero细胞的增殖及其检测病毒含量的影响。结果表明:不同培养时间和不同血清浓度对vero细胞增殖有显著作用,其中细胞培养72 h时,添加10%血清的细胞增殖显著高于不添加血清和添加5%血清;然而在添加5%血清和10%血清培养条件下,vero细胞检测活疫苗TCID50值的差异不显著。结果说明vero的最佳培养条件为10%血清、培养72 h,但血清浓度对vero细胞检测病毒含量的影响不大。

基于Vero E6细胞的水痘-带状疱疹病毒抗膜抗原荧光抗体试验的建立与评价

目的 建立并评价基于非洲绿猴肾细胞(Vero E6)的水痘-带状疱疹病毒(VZV)抗膜抗原荧光抗体(FAMA)试验方法。方法 在VZV-Oka减毒活疫苗株在Vero E6细胞中的适应培养毒株VZV-Oka-E6的基础上,首先使用3个不同感染剂量(10、10和10TCID)的VZV-Oka-E6病毒株感染Vero E6细胞,于显微镜下观察病变情况确定最佳的VZV-Oka-E6病毒株感染量;然后对比使用不同固定液固定感染细胞后制备的固定抗原片可检测到的灵敏度确定最优的固定液,从而建立基于Vero E6细胞的中和抗-VZV检测FAMA试验方法;采用建立的FAMA法,检测不同效价的VZV免疫球蛋白国际标准品,确定该方法的敏感性;检测人单纯疱疹病毒(HSV)1、2型特异性抗体,评价该方法的特异性;分别使用同一批次制备和4个不同批次制备的VZV感染细胞固定抗原片检测VZV免疫球蛋白国际标准品的中和抗-VZV,确定该方法的批内和批间重复性;检测已知的3种效价的VZV免疫球蛋白国际标准品,评价该方法的相对准确性。分别应用新建立FAMA法和ELISA法检测20(人)份单采血浆样品的抗-VZV效价,对2种试验检测结果做Spearman相关性分析。结果 通过优化确定了FAMA试验中最佳的VZV-Oka-E6病毒株感染量为10TCID,-20℃预冷的丙酮作为固定液。FAMA试验检测中和抗-VZV效价的灵敏度为31.25 mIU/mL;检测HSV 1、2型特异性抗体时结果为阴性;使用同一批次和4个不同批次制备的VZV感染细胞固定抗原片检测VZV免疫球蛋白国际标准品,变异系数分别为29.95%和26.71%;对3种效价VZV免疫球蛋白国际标准品的检测(值)与其理论值一致;FAMA法和ELISA法对20份单采血浆样品检测抗-VZV结果的相关系数为0.268。结论 所建立的FAMA试验检测中和抗-VZV效价具有良好的敏感性、特异性、重复性和相对准确性,可用于单采血浆和水痘-带状疱疹免疫球蛋白(VZIG)产品的中和抗-VZV效价检测。

产Vero细胞毒大肠菌及其感染

近十年来,西方国家肠道感染研究,最重要进展之一是:确认了产Vero细胞毒大肠菌(VTEC),为引起腹泻和严重的出血性结肠炎(HC)和溶血性尿毒综合征(HUS)的病因。VTEC又名肠出血大肠菌(EHEC),或Vero细胞毒源性大肠菌(Verotoxigenic E. coli)。VTEC感染在西方国家、日本已成为危害严重的公共卫生问题。我国至今仅有个别病例报告(195)。为引起重视,将国外研究进展介绍如下,供参考。 1977年,Konowalchuk等(1—3)在研究Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是否可用来测定大肠菌不耐热肠毒素(LT)时。

黄精多糖的抗单纯疱疹病毒作用

体外抗单纯疱疹病毒试验表明 :黄精多糖对非洲绿猴肾细胞 (Verocell)的最大无毒浓度为 16mg/mL .在对Vero细胞无毒性的浓度下对单纯疱疹病毒 1型 (Stoker株 )和 2型 (333株和Sav株 )均有显著的抑制作用 .对Stoker株的半抑制浓度 (IC50 )为 3 .95mg/mL ,最小有效浓度 (MIC)为 1.0mg/mL ;对 333株的IC50 为 8.0mg/mL ,MIC为 8.0mg/mL ;对Sav株的IC50 为 7.72mg/mL ,MIC为 4mg/mL .MTT染色的结果表明 ,黄精多糖能显著提高病毒感染的Vero细胞的活力 ,对细胞有保护作用 .图 1表 4参