非洲绿猴肾细胞(Vero)无血清细胞库的建立

目的建立Vero细胞无血清细胞库。方法采用序贯适应和直接适应方法,将Vero细胞从有血清培养适应到无血清培养,建立Vero细胞无血清细胞主库和工作库,采用STR图谱并结合染色体计数对Vero细胞进行鉴别,并对Vero细胞无血清细胞库进行致瘤性和病毒外源因子检定。结果两种方法均能使Vero细胞适应到无血清培养,其中直接适应法可大大缩短适应代次,因此选择其作为建立Vero细胞无血清细胞库的方法。Vero细胞无血清主库和工作库的STR图谱与日本细胞库公布的Vero细胞STR图谱完全一致,Vero细胞库无外源因子污染,无致瘤性。结论Vero细胞无血清细胞库可用作生物制品生产用候选细胞基质。

氧氟沙星与Cu^(2+)复合物对非洲绿猴肾细胞(Vero)的毒性效应

抗生素氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)与重金属铜离子(Cu^(2+))复合污染对离体培养的非洲绿猴肾细胞(Vero)的生长抑制作用及毒性效应,是值得关注的热点问题。通过模拟试验,研究了抗生素OFL与Cu^(2+)及其复合物对非洲绿猴肾活体细胞(Vero)的毒性效应。在正常体细胞环境下培养非洲绿猴肾细胞(Vero)3 d,加入OFL浓度为0.63、1.25、2.5、5、10 mg·L^(-1),加入Cu^(2+)浓度为2.75、6.88mg·L^(-1),反应24 h,并通过MTT法检测OFL与Cu^(2+)及其复合物对非洲绿猴肾细胞生长的抑制率。结果表明:OFL与Cu^(2+)及其复合物会导致细胞形态变化,细胞破碎,贴壁率降低。随着Cu^(2+)浓度增加,Vero细胞生长抑制率逐渐上升;OFL对Vero细胞生长有显著的影响。在2.75 mg·L^(-1)Cu^(2+)浓度时,OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞的抑制率在30%到36%之间;当OFL浓度为2.5、5、10 mg·L^(-1)时,OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞的抑制率与OFL、Cu^(2+)单一抑制率之和有显著差异,但随OFL浓度的变化没有显著差异;在6.88 mg·L^(-1)Cu^(2+)浓度处理时,OFL浓度为1.25、2.5 mg·L^(-1)时,OFL与Cu^(2+)复合物对细胞抑制率的实测值与OFL、Cu^(2+)单一抑制率之和之间没有显著差异;而当OFL浓度为0.63、5、10 mg·L^(-1)时,OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞抑制率的实测值显著低于OFL、Cu^(2+)单一抑制率之和;OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞的抑制率随着OFL浓度的增加而增加。OFL与Cu^(2+)的复合物会对Vero细胞产生毒性效应,并表现为抑制细胞生长,对细胞产生了复合污染;OFL与Cu^(2+)的复合物对细胞生长的抑制率小于OFL与Cu^(2+)单一对细胞生长抑制率之和,OFL与Cu^(2+)对细胞生长的毒性具有拮抗作用。

非洲绿猴肾细胞外源绿色荧光蛋白基因表达的RNA干扰

非洲绿猴肾细胞 (Vero)是多种病毒的适应细胞。本研究将外源的绿色荧光蛋白 (GFP)基因转染到Vero-E6中 ,并利用体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA(siGFP)对其表达进行干扰。结果显示 :siGFP能有效阻断外源的绿色荧光蛋白基因在Vero -E6细胞中的表达 ,而不相关的siRNA则对绿荧光蛋白基因的表达没有影响。这为利用RNAi技术在Vero -E6细胞中 ,抑制外源基因的表达以及通过RNAi技术进行抗病毒的研究奠定了一定的基础。

锁阳多糖对H_2O_2诱导非洲绿猴肾上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的研究锁阳多糖对过氧化氢(H2O2)诱导非洲绿猴肾上皮(Verda Reno,简称VERO)细胞损伤的保护作用。方法建立H2O2致VERO细胞氧化损伤模型,MTT法检测细胞存活率;通过荧光光度法检测caspase-3活性;利用荧光探针DCFH-DA对荧光染色的胞内活性氧(ROS)检测其荧光强度;化学比色法测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,以及细胞培养液中丙二醛(MDA)水平。结果锁阳多糖能明显改善H2O2诱导的VERO细胞的氧化损伤,与模型组相比,锁阳多糖组可使细胞存活率升高,细胞内的ROS的积累量显著降低(P<0.01),caspase-3活性下降(P<0.05),同时细胞内的SOD和GSH-Px活性明显增加(P<0.01),细胞培养液中的MDA水平明显降低(P<0.01)。结论锁阳多糖能对H2O2诱导的VERO细胞的氧化损伤保护提示其具有潜在的防治肾脏相关疾病的作用。

四氯化碳对非洲绿猴肾细胞损伤机理的研究

目的 实验研究四氯化碳染毒 2 4h对非洲绿猴肾细胞的损伤及其机理。方法 运用显微荧光术测定非洲绿猴肾细胞 (Vero细胞 )内活性氧 (ROS)含量及游离Ca2 + 浓度 ,同时 ,测定Vero细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力用于检查Vero细胞受损情况。结果 接触浓度为 1 0mmol L四氯化碳的Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 + 浓度与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,同时 ,表示Vero细胞受损指标 (LDH活力 )差异也无显著性 (P >0 .0 5 ) ;而接触浓度为 4 0、8.0mmol L四氯化碳的Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 + 浓度均显著性高于对照组 (P <0 .0 1) ,其Vero细胞受损也均显著性增加 (P <0 .0 1)。结论 较高浓度的四氯化碳能损伤Vero细胞 ,其损伤的可能途径是通过提高Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 + 浓度。

1,2-二氯乙烷对非洲绿猴肾细胞损伤机理的离体试验研究

目的 了解 1,2 二氯乙烷对非洲绿猴肾细胞的损伤及其机理。方法 采用 0 5、1 0、2 0mmol/L 3个剂量 1,2 二氯乙烷处理非洲绿猴肾细胞 (Vero细胞 ) 2 4h,并运用显微荧光术测定处理后的Vero细胞内活性氧 (ROS)含量及游离Ca2 + 浓度 ,用比色法测定Vero细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力。设立对照组。结果 接触 1 0、2 0mmol/L 1,2 二氯乙烷的Vero细胞内游离Ca2 + 浓度及其上清液LDH活力均高于对照组 (P <0 0 1) ,而 0 5mmol/L染毒组的Vero细胞内游离Ca2 + 浓度及其上清液LDH活力与对照组比较差异均无显著性 (P >0 0 5 )。各剂量组的Vero细胞内ROS含量与对照组比较差异均无显著性 (P >0 0 5 )。结论 较高浓度的 1,2 二氯乙烷能损伤Vero细胞 ,其损伤的可能途径是通过增加细胞内游离Ca2 + 浓度。

氯仿对非洲绿猴肾细胞损伤机理的研究

目的 实验研究氯仿染毒 2 4h对非洲绿猴肾细胞的损伤及其机理。方法 运用显微荧光术测定了非洲绿猴肾细胞 (Vero细胞 )内活性氧 (ROS)含量及游离Ca2 + 浓度 ,同时 ,测定Vero细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力用于检查Vero细胞受损情况。结果 接触浓度为 4 0mmol L氯仿的Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 +浓度与对照组比较无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,同时 ,表示Vero细胞受损指标 (LDH活力 )也无显著性差异 (P >0 0 5 ) ;而接触浓度为 8 0mmol L、12 0mmol L氯仿的Vero细胞内ROS含量显著高于对照组 (P <0 0 1) ,其Vero细胞受损也显著增加 (P <0 0 5、P <0 0 1)。结论 较高浓度的氯仿能损伤Vero细胞 。

黄曲霉毒素B1对非洲绿猴肾细胞的毒性效应及作用机制研究

目的探讨黄曲霉毒素B1(AFB1)对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)的毒性效应及其作用机制。方法体外培养Vero E6细胞,不同浓度AFB1处理细胞后,采用CCK-8法检测细胞存活率;检测乳酸盐脱氢酶(LDH)释放率;利用Annexin V/PI双染、DAPI染色研究细胞死亡机制。结果 AFB1对Vero E6细胞有显著毒性损伤效应,200μmol/L AFB1处理Vero E6细胞48h后,细胞存活率不到10%。细胞LDH释放率随着AFB1浓度增加而显著升高。Annexin V/PI染色检测到细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻。DAPI染色检测到细胞核碎裂。结论 AFB1对Vero E6细胞具有明显的毒性损伤作用,其可能通过凋亡的机制引起细胞死亡。

非洲绿猴肾细胞株AGMr(HindⅢ)-1高度重复顺序的克隆及初步应用

从非洲绿猴肾细胞株分离高度重复顺序AGMr（HindⅢ）－1基因，以pUC18质粒为载体构建重组质粒pUC18／AGMr（HindⅢ）－1，转化E．coliJM83。酶切分析、SouthernBlot分析和序列分析均证明克隆成功，但所用的第165代Vero细胞株与另一非洲绿猴肾BSC－1细胞株的序列相比较，172个碱基中有6个位点突变。用该重组质粒作探针，对Vero细胞培养的狂犬疫苗作SouthernBlot分析表明，未经纯化的半成品中残余细胞DNA长度约400～5000bp。斑点杂交分析表明，杂交特异性良好，残余细胞DNA最小检出量约4pg。提示AGMr（HindⅢ）－1高度重复顺序可特异地应用于Vero细胞残余DNA检测。

受损伤非洲绿猴肾细胞调控CaOx晶体的成核与生长

目的是研究H2O2对非洲绿猴肾细胞(VERO)的氧化损伤作用及损伤后细胞对草酸钙(CaOxa)晶体成核与生长的诱导作用。方法:采用CCK-8法检测H2O2对VERO的增值抑制作用,建立VERO细胞的氧化损伤模型,并用倒置显微镜和SEM观测细胞的形态变化及晶体生长情况。结果:0.1mM的H2O2作用VERO细胞20min即能引起较为明显的损伤,且随作用时间的延长而损伤程度加重。结论:H2O2能明显地损伤细胞,降低细胞的存活率,且在0～60min的时间范围和0～1.0mM的浓度范围内呈时间依赖性和浓度依赖性;CaOxa晶体的成核与生长受VERO细胞的调控,表现为诱导形成的晶体形貌和尺寸方面的不同。

非洲绿猴肾上皮细胞损伤及诱导草酸钙晶体

采用非洲绿猴肾上皮细胞系（Vero）为研究对象，建立了其H2O2氧化性损伤模型，研究了正常与损伤不同程度的Vero细胞诱导草酸钙（CaOxa）结晶的差异，采用CCK-8法检测了细胞的活力；采用流式细胞术检测了细胞的线粒体膜电位的变化；采用扫描电子显微镜（SEM）观察了Vero细胞的形态变化和所诱导的晶体．结果表明，损伤程度不同的Vero细胞在过饱和的CaOxa溶液中，诱导CaOxa晶体的情况存在差异，细胞损伤程度越严重，就会加剧诱导CaOxa晶体的生长．

非洲绿猴肾细胞传代培养中细胞消化液的优化试验

通过比较0.25%胰蛋白酶和改良的细胞消化液(0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶)对非洲绿猴肾(Vero)传代细胞系的消化分散效果,确定最适合实际生产需要的细胞消化液。结果表明,用改良的细胞消化液消化Vero传代细胞系,消化时间短,消化效果好,优于0.25%胰蛋白酶的消化效果。

甲肝病毒在猴胚肾细胞和Vero细胞上的分离与适应

使用恒河猴胚肾 (MEK)细胞从临床标本中分离和适应了甲肝病毒W和X ,通过阻断实验、中和实验、免疫荧光和免疫电镜实验、RT PCR对其进行特异性鉴定 ,证明是甲肝病毒。W株和X株第 7代在MEK细胞上的抗原滴度分别为 1∶5 12、1∶10 2 4,感染滴度 (logTCID50 /mL)分别为 8.17、8.5 0。只有分离株W可以适应于Vero细胞 ,第 6代 2 1d抗原滴度为 1∶2 5 6 ,感染滴度 (logTCID50 /mL)为 8.0 0。

肾综合征出血热Vero传代细胞疫苗的研究

目的 研究肾综合征出血热 (HFRS)Vero传代细胞疫苗。方法 将HFRS双价沙鼠肾细胞灭活疫苗的生产疫苗株Z10 (Ⅰ型 )、Z3 7(Ⅱ型 )适应到Vero细胞上进行连续传代 ,并用不同代次的Vero细胞适应株制备Vero传代细胞疫苗。结果 Z10 、Z3 7株感染Vero细胞后第 1代即可达到较高病毒滴度 ,并且在Vero细胞中持续传代适应 ,病毒滴度分别维持在 6.2 5～ 6.75和 6.5 0～ 7.0 0logTCID50 /ml之间 ,较为稳定。用不同代次的Vero细胞适应株制备而成的HFRSVero细胞灭活疫苗抗原效价和疫苗的病毒滴度有较大提高 ,反向间接血凝效价从Z10 Cp1Vero细胞疫苗的阴性上升到Z10 Cp10 Vero细胞疫苗的 1∶64 ,从Z3 7Cp1Vero细胞疫苗的 1∶2上升到Z3 7Cp10 Vero细胞疫苗的 1∶64 ;疫苗病毒滴度(logTCID50 /ml)从Z10 Cp1Vero细胞疫苗的 4.2 5上升到Z10 Cp10 Vero细胞疫苗的 6.5 0 ,从Z3 7Cp1Vero细胞疫苗的 6.2 5上升到Z3 7Cp10 Vero细胞疫苗的 7.5 0。疫苗在抗原量和病毒滴度上基本符合中国生物制品的要求。结论 HFRSVero传代细胞疫苗的生产 ,疫苗株在Vero细胞中的连续传代适应起关键性作用。

加强疫苗生产用Vero细胞控制的思考

日本千叶大学的Y．Yasumura和Y．Kawakita两位学者于1963年研制出Vero细胞系，来源于非洲绿猴肾（Cercopithecusaethiops）上皮细胞。1964年，Simizu博士将第93代的Vero细胞提供给英国的Tropical病毒实验室（NIAID，NIH）。1979年，第113代Vero细胞提供给美国标准菌种保藏中心（AmericaTypeCultureCollection，ATCC），传代至第121代建立细胞库。Vero细胞为连续细胞系，

附红细胞体对Vero细胞生长的影响及其临床应用前景

目的 观察附红细胞体对非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)生长的影响。方法 取附红细胞体感染病人的全血与 Vero细胞共同培养;细胞培养物进行SDS PAGE蛋白质电泳。结果 附红细胞体感染Vero细胞后,Vero细胞形态改变;蛋白 质电泳图谱显示附红细胞体阳性培养物较阴性培养物多三条蛋白条带。结论 附红细胞体附着Vero细胞并引起Vero细胞 形态改变,附红细胞体存在分子量分别为18.4kD、25.0kD和45.0kD的三种蛋白。

放线菌素D诱导非洲绿猴肾细胞(Vero)凋亡模型的建立

用不同剂量(0,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 mg/L)的放线菌素D(actinomycin D,ActD)诱导Vero细胞凋亡不同时间(0,12,24,36,48,60 h)。MTT法和流式细胞术的结果显示,以未处理的细胞作为对照组,各剂量ActD处理Vero细胞不同时间后,细胞的活力均下降,凋亡率均升高,且呈剂量和时间依赖效应。当ActD浓度为1 mg/L、作用时间为36 h,细胞的存活率为(0.55±0.01),凋亡率为(34.83±1.13)%。Gimesa染色、Hoechst33258染色表明,经ActD(1 mg/L)诱导36 h后Vero细胞形态学发生明显改变,出现膜小泡和凋亡小体形成等凋亡细胞特征;Real-time PCR结果显示,诱导组Bax/Bcl-2 mRNA相对含量明显大于正常对照组,且差异有统计学意义;分光光度法结果表明,与正常对照组相比较,凋亡诱导组caspase-3和caspase-8活性明显升高且差异具有统计学意义,caspase-9活性与对照组相比较,差异无统计学意义。用1 mg/L ActD诱导Vero细胞36 h时,细胞存活率和凋亡率都很高,可作为ActD诱导Vero细胞的最佳剂量。在该剂量及作用时间下,caspase-3和caspase-8活性明显升高,表明ActD诱导Vero细胞凋亡是通过caspase-8相关的途径。该实验成功建立了ActD诱导非洲绿猴肾细胞凋亡模型,将有助于进一步探讨目的基因在Vero细胞凋亡作用的的分子机制。

病毒疫苗制备用不同核型VERO细胞系在裸鼠体内致癌/致瘤性的系统实验研究(英文)

生产疫苗用细胞系可能具有致瘤性 ,一些常用的细胞系需要检查不同代次有无致癌性。在建立传代细胞种子库与工作库基础上 ,对研制生产病毒活疫苗所用 8株VERO细胞系在 2 19只裸鼠进行了致癌 (瘤 )实验。本研究结果表明 ,VERO细胞染色体核型可发生变异 ,亚四倍体JA株与超二倍体KA株具有强的致癌性 ,不能用于致弱活病毒疫苗制备 ,但可替代HeLa细胞系用作恶性肿瘤阳性对照细胞。筛出无致瘤性的YB、JC、M和JB株亚二倍体VERO细胞系 ,可替代BHK 2 1细胞用于狂犬病减毒活疫苗制备。VERO细胞系染色体遗传相对稳定 ,不同代次变化不大。研究发现细胞染色体遗传特征决定致瘤性质并具有种属特异性 ,不同核型细胞致瘤性不同 ,细胞染色体数目变异大小和致癌性成正相关 ,通过体内外交替选育可在裸鼠体内快速选育成功高变异率肿瘤细胞系。高变异率HeLa或VERO细胞系移植于裸鼠可能产生恶性横纹肌样瘤。因此 ,应当强调疫苗生产用细胞系致瘤性评价的重要性。

抗菌肽葛佬素在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达及其活性的初步分析

目的 观察自行设计的葛佬素cDNA在非洲绿猴肾细胞株COS 7中的表达及其表达产物的抗菌作用。 方法 分析同种族蛋白质AttacinAcDNA序列各种遗传密码子的出现频度 ,结合已知的葛佬素蛋白质序列 ,设计、合成其cDNA序列。经测序验证后 ,将葛佬素基因插入真核细胞表达载体pCDSI中 ,构建载体pBZHG。随后以脂质体为载体 ,对COS 7细胞进行质粒pBZHG和空载体pCDSI的转染 ,72h后收集细胞培养上清液 ,进行杀菌活性的检测 (以正常COS 7细胞培养上清作对照 )。 结果 人工设计的葛佬素cDNA序列在COS 7中得到表达。与转染空载体的细胞和正常细胞比较 ,转染pBZHG的COS 7细胞培养上清对大肠杆菌J5具有杀菌活性。 结论 笔者所设计的葛佬素cDNA序列是正确的 ,由此可为深入研究葛佬素的抗菌及抗内毒素作用提供实验依据。