兔前腔静脉心肌细胞动作电位和非特异性阳离子通道电流特性的研究

作为阵发性房颤的另外一个重要异位兴奋灶的起源部位,与右心房相比,上腔静脉有着独特的电生理学特性.本实验中,通过对兔的前腔静脉观察发现,在不同刺激频率下,前腔静脉心肌细胞APD90明显大于右心房;右心房和前腔静脉心肌细胞均可出现传导阻滞;少数前腔静脉心肌细胞可出现类似起搏细胞的慢反应动作电位与早期后去极化(EAD).进一步对去极化的电流进行分析时,实验证明,兔右心房和前腔静脉心肌细胞均存在一种特殊的离子通道电流:非特异性阳离子通道电流(nonselective cation current INs);前腔静脉的INs峰值电流密度小于右心房;去除细胞外二价阳离子和葡萄糖的灌流液可激动这种INs;在右心房心肌细胞上阻断INs,动作电位时程明显增大;在前腔静脉心肌细胞上激动INs,动作电位时程缩短.结果表明,前腔静脉心肌细胞具有异位激动能力及传导阻滞的条件;兔右心房和前腔静脉心肌细胞的动作电位时程的大小存在显著差异,部分由于INs在二者之间分布的差异所致;INs的激动剂或阻滞剂可以影响兔右心房或前腔静脉心肌细胞动作电位时程,从而可能影响前腔静脉出现早后去极化和电传导阻滞的发生.兔心房上的INs与TRPC3通道非常近似,它在阵发性心房颤动机制中可能起到一定的作用.

兔左室三层心肌细胞非特异性阳离子电流的特性

目的研究兔左室除钾电流外是否还存在其它复极外向电流,并进一步研究其在三层心肌细胞上的分布。方法采用胶原酶二步消化法分离兔心肌细胞,用锐利眼科剪分离左室游离壁内、中、外三层心肌,改变灌流液的成份,采用全细胞膜片钳记录离子电流。结果在兔左室肌细胞记录到一种新的电压依赖性、非特异性阳离子电流。该离子通道对Na+、K+、Li+、Cs+通透,对Cl-不通透,能够被Gd3+和La3+阻断。该通道在三层心肌细胞的密度分布不同,中层心肌细胞的电流密度明显小于内层和外层心肌细胞。结论非特异性阳离子电流参与了兔左室心肌细胞的电生理异质性的形成。

心肌细胞非特异性阳离子通道和离子流的研究进展

心肌细胞上存在瞬时感受器电位通道蛋白,介导形成多种非特异性阳离子通道,包括细胞外二价阳离子敏感的非特异性阳离子流、背景性非特异性阳离子流、胰岛素激活的非特异性阳离子流、牵张激活的非特异性阳离子流和瞬时内向电流等。它们在调节细胞静息电位水平和诱发生理及病理性心律失常中可能发挥重要作用。

超极化激活环核苷酸门控的超极化阳离子通道在神经系统中的分布与功能

对超极化激活环核苷酸门控的超极化阳离子通道（hyperpolarization—activated cyclic nucleotide—gated cation channel，HCN）的研究起源于Ih的发现，1976年Noma首次报道在家兔心脏窦房结组织记录到一种超极化激活的内向电流，称为。

超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道与疾病关系的研究进展

随着对超极化激活电流和超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道研究的不断深入，人们对超极化激活电流特性和超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道的结构特征、调节、分布有了进一步的了解。近年来，发现除心律失常之外，超极化激活电流异常和超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道的机能障碍还与其他多种疾病有关。本文就超极化激活电流特性、超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道的特点及二者功能异常与疼痛等神经系统疾病关系的最新研究进展予以综述。

起搏通道基因亚型HCN4重组腺病毒载体的构建及通道电流检测

目的旨在构建超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4(HCN4)重组腺病毒载体并鉴定其离子通道功能。方法全长人HCN4基因酶切后亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,形成含目的基因和绿色荧光蛋白基因的穿梭载体。穿梭载体和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法在BJ5183大肠杆菌中同源重组,重组后的腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,利用脂质体介导转染到HEK293细胞进行病毒的包装和扩增。用多聚酶链反应(PCR)方法对病毒上清中的HCN4进行检测,并将重组腺病毒感染COS-7细胞,用免疫荧光染色检测HCN4蛋白质的表达,利用全细胞膜片钳方法测定转HCN4基因细胞的电生理功能。结果通过酶切、测序、PCR等证实HCN4通道基因重组腺病毒载体构建正确,免疫荧光检测证实转染AdHCN4的COS-7细胞中HCN4通道基因的表达,膜片钳实验也在转基因细胞中检测到超极化激活的非选择性内向阳离子电流(If)。结论HCN4通道基因重组腺病毒载体的构建成功为进一步研究该离子通道的电生理功能及在心律失常疾病基因治疗方面的潜在应用价值奠定了基础。

HCN通道在听觉传导通路中的作用研究进展

超极化激活环核苷酸门控阳离子通(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN channel)广泛表达于中枢和周围神经系统,通过其介导的超极化激活阳离子电流(hyperpolarization-activated cation current,Ih)调节神经元的静息膜电位和兴奋性来影响听觉的精确加工和传导,对时间信息的精确分析起着至关重要的作用。因此,本文通过对HCN通道结构和分布以及电生理作用进行综述,进一步探讨HCN通道在正常及单侧聋或双侧聋情况下听觉传导通路中的作用及机制。

窦房结细胞起搏与超极化激活的环核苷酸门控通道关系的研究进展

窦房结是正常心脏活动的起搏点,窦房结细胞的自律性决定心率的快慢,而窦房结细胞4期自动除极是其产生自律性的基础,该过程是通过窦房结细胞膜上多种离子流的共同作用而实现的,其中超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道(HCN)及其产生的电流(If电流)在窦房结细胞起搏电活动中具有重要作用。本文探讨窦房结细胞起搏与超极化激活的环核苷酸门控通道的关系,为临床治疗病态窦房结综合征等缓慢性心律失常提供新的方向。

小鼠耳蜗螺旋神经节细胞Ih电流的研究

目的了解小鼠耳蜗螺旋神经节细胞超极化激活阳离子通道电流(Ih电流)的基本电生理学特性。方法应用全细胞构型电压钳制技术,采用不同的阻断剂,记录Ih电流。结果实验记录到了Ih电流,对BaCl2不敏感,但可被5 mM CsCl抑制,冲洗后电流恢复,符合Ih电流的药理学特点,其反转电位为-40.5±7.2 mv,二分之一最大活化电压(V1/2)为-103.3 mv,斜率(K)为10.5;在-160 mv钳制电压条件下其活化过程符合二次幂方程,时间常数分别为66.2 ms和403.7 ms,不同部位之间Ih电流的活化时间常数无明显差异(P>0.05)。结论Ih电流对不同部位耳蜗螺旋神经节细胞完成其功能所起的作用可能是相似的,但需要进一步的深入研究。

硝普钠对豚鼠单离耳蜗外毛细胞全细胞电流的影响

目的研究并探讨硝普钠(sodiumnitroprusside,SNP)对豚鼠耳蜗外毛细胞(outerhaircells,OHC)全细胞电流的影响及其作用机制。方法利用急性分离的OHC和特异性的离子通道阻断剂作为工具药,通过膜片钳电压钳记录技术观察了SNP对豚鼠耳蜗OHC全细胞电流的影响,结果①在以+40mV的指令电压刺激时,10-3mol/L的SNP抑制15.34±6.59%的细胞电流(n=5);②SNP对全细胞电流的抑制作用有电压依赖性,在刺激高于0mV时作用明显,10-2mol/L的SNP在+10mV时抑制率为4.97±1.74%,而在+40mV时的抑制率为33.82±1.61%;③SNP对全细胞电流的抑制呈量效关系,在浓度大于10-3mol/L时,抑制作用逐渐明显,10-1mol/L的SNP时接近达到最大抑制效应;④分离离子电流成分后,SNP仅对Ca2+电流有抑制作用。结论SNP对豚鼠耳蜗外毛细胞的全细胞电流的抑制作用,主要通过抑制细胞外Ca2+的内流,进而影响Ca2+依赖性K+通道而实现。

I_(h)电流在大鼠臂旁外侧核热敏神经元温敏形成中的作用

目的探讨超极化激活环核苷酸门控性阳离子通道蛋白(HCN)介导的I_(h)电流是否参与大鼠臂旁外侧核(LPBN)神经元温度敏感性的形成。方法选取雄性SD大鼠为实验动物,采用实时定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)检测6只大鼠HCN通道的主要亚型;采用免疫荧光检测其主要亚型在LPBN分布;采用全细胞脑片膜片钳电流钳技术鉴定大鼠LPBN神经元温度敏感性,然后在全细胞电压钳模式下进一步检测温度变化对不同类型LPBN神经元I_(h)电流的影响。结果采用real-time qPCR技术在6只大鼠的LPBN均检测到HCN1、HCN2、HCN3和HCN4 mRNA表达,其中,HCN2 mRNA表达丰度最高,HCN4 mRNA表达丰度最低。免疫荧光染色结果显示,HCN2通道在中央亚核、背亚核和外亚核3个LPBN亚核均有表达。脑片膜片钳全细胞实验显示,当膜电位为-120 mV时,温度升高引起LPBN热敏神经元I_(h)电流幅度增加、激活时间常数缩短、激活速度加快(n=7,P<0.05),但温度对冷敏神经元(n=5)和温度不敏感神经元(n=17)的I_(h)电流幅度、激活时间常数与激活速度差异无统计学意义(P>0.05)。LPBN热敏神经元I_(h)电流激活速率的Q10值明显高于温度不敏感神经元(P<0.05),其I_(h)电流激活时间常数和激活速率的Q10值与放电频率温敏系数分别呈负相关和正相关。结论I_(h)电流的温度依赖性激活参与了LPBN热敏神经元的温敏形成。

C型伤害感受器兴奋性增加和Ih电流增强参与慢性炎症痛机制

慢性炎症痛主要是外周组织损伤和炎症引起，包括外周敏化和中枢敏化两种发病机制。以往研究外周敏化的分子机制，主要在炎症痛急性期（≤3d）进行，而炎性痛后期（≥5d）的分子机制研究很少。超级化激活环核苷酸门控阳离子通道（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel，HCN）由1-4个亚型组成，它在膜电位回复到静息电位附近时被激活，产生兴奋性的内向电流Ih。

小鼠足细胞特异性过表达Trpc6可致肾小球疾病

瞬时受体电位阳离子通道6（TRPC6）钙通道基因的突变常伴随着局灶节段性肾小球硬化（FSGS）,从而影响成人和儿童的健康。此外,获得性肾小球疾病也伴随着TRPC6的表达水平的增加。

HCN2通道在炎症痛和神经病理痛发挥重要作用

痛觉感受器的动作电位发放频率是衡量痛程度的主要参考因素。而超级化激活环核苷酸门控阳离子通道（Hyperpolarization—activatedcyclicnucleotide-gatedcationchannel，HCN）是影响动作电位发放频率的主要通道之一。HCN通道家族包含四个亚型，HCNl、HCN2、HCN3和HCN4，它们都表现为在膜电位-60至-90mV时超极化引起的内向电流，称为Ih电流。在心肌，HCN通道的激活引起的电流是驱动心脏起搏的主要电流。

重组慢病毒介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4基因转染BMSCs的实验研究

目的探讨重组慢病毒（1entivirus，LVs）介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4（hyperpo。larization．activatedcyclicnucleotide．gatedcationchannel4，HCN4）基因转染大鼠BMSCs构建生物起搏细胞的可行性。方法选取3～5周龄SD大鼠，采用改良全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs。以LVs作为转染载体，增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）为标记，构建LVs．HCN4．EGFP病毒液。取第3代BMSCs分别转染LVs—HCN4．EGFP病毒液（实验组）和LVs．EGFP空白病毒液（对照组），荧光显微镜观察转染24、48、72h后两组绿色荧光表达情况，72h时Westernblot检测HCN4蛋白表达；电生理检测实验组转染72h后BMSCs的起搏电流。结果实验组BMSCs形态正常、生长良好；48h后荧光显微镜下可见散在的绿色荧光，转染效率约10％；72h荧光表达稍增多，转染效率为20％～25％。对照组未见绿色荧光表达。Westernblot检测示转染72h后，实验组可见与HCN4蛋白相对分子质量相同的条带表达，而对照组仅有微弱表达；实验组蛋白条带灰度值为33．75±0．41，显著高于对照组的23．39±0．33（t=17．524，P=-0．013）。实验组转染后的BMSCs检测到起搏电流，并能被CsCl完全阻断，符合起搏电流特点。结论重组LVs介导HCN4基因成功转染大鼠BMSCs，并检测到HCN4蛋白表达及起搏电流。

人精子RNA的提取及含量分析

目的建立可靠的提取人精子RNA的方法，分析其含量并用于检测基因mRNA。方法9例正常精液标本液化后，经Percoll纯化，用体细胞裂解液（含0．1％十二烷基硫酸钠和0．5％Triton X-100的水溶液）于O℃处理15min去除精子以外的细胞。用RNeasy Kit提取精子RNA，微量核酸测定仪测定RNA量。RNA用于逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），检测β-Actin、精子特异性阳离子通道2（CatSper2）、鱼精蛋白2（Protamine-2）mRNA，同时，检测c-Kit、CD4、上皮细胞钙粘蛋白（E-Cadherin）mRNA，分别排除生精细胞、白细胞和上皮细胞的污染。结果体细胞裂解液于0℃处理15min能去除精子以外的细胞，使精子RNA提取量提高（2．2～4.9倍）。9例正常精液标本RNA量为（233．5±75．3）ng／10^6精子。所有标本RNA用RTPCR，均成功扩增β-Actin、CatSper2、Pmtamine-2，但扩增c-Kit、CD4、E-Cadhefin未见目的条带。结论人精子中含微量RNA，本提取方法能提取人精子中微量RNA，且避免其他细胞污染，可供人精子RNA研究和临床检测选用。

伊伐布雷定增加心房颤动发生的可能机制及临床应用注意事项

伊伐布雷定在降低窦性心律下心力衰竭或冠心病患者的心室率方面有明显益处。但临床实践提示,伊伐布雷定的应用会增加非心房颤动(房颤)患者的房颤发生风险。基于相关临床和基础研究证据,本文将系统阐述伊伐布雷定增加房颤发生风险的可能机制,并为伊伐布雷定的临床应用提供注意事项。

转染人TBX18基因的大鼠心脏成纤维细胞中HCN4蛋白表达、If及对心肌细胞搏动频率的影响观察

目的：观察转染人TBX18基因的大鼠心脏成纤维细胞HCN4蛋白表达、超极化激活内向离子电流（If）及对心肌细胞搏动频率的影响。方法取新生SD大鼠，断头处死后取心脏，分离培养成纤维细胞及心肌细胞。构建人TBX18基因的腺病毒载体Ad-GFP-TBX18，包装并纯化病毒滴度至1＆#215;1010 TU／mL。取传代2～5代时对数生长期新生大鼠成纤维细胞分为A、B、C组，培养24 h后A、B组分别转染Ad-GFP-TBX18、腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP（阴性对照），C组不做任何处理。采用RT-PCR法检测各组细胞TBX18 mRNA。采用Western blotting法检测各组超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4（HCN4）蛋白。采用电压钳记录各组细胞超极化激活内向离子电流（If）。将各组细胞与新生大鼠心肌细胞共培养，观察新生大鼠心肌细胞搏动频率。结果 A、B、C组TBX18 mRNA相对表达量分别为98．32±6．21、1．03±0．05、1．02±0．02。A组TBX18 mRNA相对表达量高于B、C组（P均＜0．05）；B、C 组TBX18 mRNA相对表达量差异无统计学意义。A、B、C组HCN4蛋白相对表达量分别为0．49±1．21、0．12±0．02、0．09±0．01。A组HCN4蛋白相对表达量高于B、C组（P均＜0．05）；B、C组HCN4蛋白相对表达量差异无统计学意义。A组约有30％的细胞可以检测到If，而B、C组中没有细胞检测到If。同一时点A组新生大鼠心肌细胞搏动频率高于B、C组（P均＜0．05）；B、C组新生大鼠心肌细胞搏动频率差异无统计学意义。结论转染人TBX18基因的大鼠心脏成纤维细胞高表达HCN4蛋白，存在If电流，并能促进共培养新生大鼠心肌细胞的搏动。