口蹄疫重组鸡痘病毒诱导猪特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测

目的:评价口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1诱导猪产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的能力。方法:用PCR方法亚克隆O型FMDVVP1基因C末端部分片段(第1 30～2 1 3AA)。将其插入真核表达载体pDisplay中,构建质粒pDisplay- mVP1。将pDisplay -mVP1转染PK 1 5细胞,经3次G41 8加压筛选,并用RT- PCR和IFA鉴定,证明获得表达目的基因的PK 1 5 /pDisplay- mVP1细胞。最后,利用该细胞作为靶细胞,用LDH法检测口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1免疫猪的特异性CTL杀伤活性。结果:vUTAL3CP1免疫组在效靶比2 5∶1和5 0∶1时,CTL裂解活性分别达到42 . 84%±3 2. 1 %和61 . 94%±4 2. 8% ,显著高于灭活疫苗组与其它对照组(p <0 . 0 1 )。结论:vUTAL3CP1可以诱导猪产生高水平的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性,为进一步的FMDV基因工程疫苗的研究奠定了基础。

妊娠期特异性beta1糖蛋白9 HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的鉴定

目的:鉴定来自食管癌细胞中特异性高表达的妊娠期特异性beta1糖蛋白9(PSG9)的HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。方法:首先运用RT-PCR方法检测PSG9mRNA在食管癌细胞EC9706、EC-1及EC-109中的表达情况。然后通过Bimas和Syfpeithi预测,再结合NetCTL1.2选取4条来源于PSG9的HLA-A3限制性的表位。候选表位P336的2位的氨基酸由异亮氨酸替换为亮氨酸,9位的氨基酸由酪氨酸替换为赖氨酸。候选表位P378的9位氨基酸由精氨酸替换为赖氨酸。候选表位通过标准的Fmoc化学法合成,通过结合力实验检测表位与T2A3细胞表面HLA-A3分子的结合力水平,通过细胞毒实验检测对EC-1细胞毒活性。结果:PSG9在肿瘤细胞EC9706、EC-1以及EC-109中都有表达。候选表位P107、P201和P336-2L9K与HLA-A3分子有弱结合力,P336、P378和P378-9K与HLA-A3分子有中等结合力。细胞毒实验结果显示P336-2L9K、P378和P378-9K对EC-1细胞均有一定的杀伤作用。结论:多肽P336-2L9K、P378和P378-9K能诱导体外抗肿瘤免疫反应,有可能成为PSG9阳性肿瘤细胞的共同CTL表位。

丙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞功能的研究

目的研究慢性丙型肝炎患者丙型肝炎病毒(HCV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能及其与临床疾病状态的关系。方法表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1-core通过Lipofecta-mineTM基因转染法转染HepG2细胞,经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞(Hep-core),经Western blot证实有HCV核心蛋白表达;分离患者外周血单个核细胞,经体外诱导扩增获得HCV特异性CTL(HCV-CTL),以Hep-Core细胞和HepG2细胞作靶细胞,乳酸脱氢酶释放法检测HCV-CTL活性,用酶联免疫吸附法检测培养上清液中干扰素-γ(IFN-γ)含量,以正常人作为对照。结果慢性丙型肝炎患者组HCV-CTL活性值为(23.9±4.8)%,明显低于对照组(42.6±6.5)%(t=7.22,P=0.011)。高病毒载量组HCV-CTL活性值(18.9±4.8)%,明显低于低病毒载量组的(33.7±3.2)%(t=8.22,P=0.003);基因1型患者HCV-CTL活性值(20.8±2.1)%明显低于基因2或3型的(32.4±2.5)%(t=11.7,P=0.001);ALT升高患者HCV-CTL活性值(29.3±3.1)%与ALT正常患者(25.7±3.4)%相比无统计学差异(t=0.93,P>0.05)。慢性丙型肝炎患者培养上清液中的IFN-γ量(957±241)pg/ml明显低于对照组的(3117±673)pg/ml(t=8.87,P=0.001)。结论慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低,CTL的免疫功能低下与病毒水平和基因型相关而与ALT水平无关。

EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞体外诱导培养及杀伤效果鉴定

本研究旨在探讨EB病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(EBV-CTL)体外诱导和扩增培养的方法,并检测其特异性杀伤的效果。采集EBV血清抗体阳性的6例正常供体的外周血单个核细胞(PBMNC),用EBV转化的B淋巴细胞系(BLCL)作为抗原递呈细胞及抗原刺激剂,经辐照灭活后不断刺激培养自体PBMNC,诱导产生EBV-CTL,并将其扩增培养;采用流式细胞仪鉴定其免疫表型,然后检测不同效靶细胞比例条件下EBV-CTL对自体BLCL(autoBLCL)、自体植物血凝素培养的B淋巴母细胞(PHA-blast)、HLA不合供体的BLCL(alloBLCL)、K562细胞株的杀伤效果。结果表明,6例EBV血清抗体阳性正常供体来源的PBMNC在体外成功筛选并扩增培养了EBV-CTL,扩增效率为PBMNC数的18.6-55.0倍。刺激10次培养后的EBV-CTL对autoBLCL在20∶1、10∶1、5∶1三种效靶细胞比例条件下特异性杀伤效率的平均值分别为59.4%、43.2%、29.0%;对PHA-blast、alloBLCL、K562的非特异性杀伤率在上述三种效靶细胞比例下平均值依次为7.1%、9.4%、10.3%(P<0.05),6.6%、8.3%、8.1%(P<0.05),5.4%、7.3%、6.3%(P<0.05)。结论:EBV-CTL能有效在体外筛选培养并扩增,并能有效杀伤HLA相合的BLCL,可望成为EBV相关性移植后淋巴细胞增殖性疾病的过继免疫治疗的有效方法。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素C和肿瘤可溶性抗原诱导的细胞毒性T淋巴细胞的杀瘤效应

目的探讨肿瘤可溶性抗原（TSA）联合超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素C（SEC）诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对肿瘤细胞的杀伤作用。方法实验分为对照组（淋巴细胞）和实验组（SEC＋TSA＋淋巴细胞）。分离肿瘤患者外周血淋巴细胞，经TSA、超抗原SEC联合作用诱导产生CTLs，对其增殖、细胞表型、杀瘤活性进行观察和测定。结果经TSA、SEC联合刺激的淋巴细胞组增殖活性明显增强。实验组和对照组CD3均阳性表达，实验组CDs＋明显高于对照组（49．07％比27．52％，P〈0．05）。经肺癌TSA、超抗原SEC联合刺激淋巴细胞组培养诱导的CTLs，当效靶比为20：1时对CALU-6、自体肺癌细胞、Hela细胞杀伤活性明显高于效靶比为10：1[分别（89．6±3．7）％比（51．5±4．0）％，（92．0±4．0）％比（54．5±4．0）％，（65．0±3．8）％比（35．3±2．4）％，均P〈0．05]；效应细胞对人肺癌细胞株CALU-6、自体肺癌细胞的杀伤活性明显高于Hela细胞（P〈0．05）。结论经肿瘤抗原和超抗原SEC诱导的CTL能够产生高效特异性的杀瘤效应。

慢性HBV感染者特异性细胞毒性T淋巴细胞及HLA-A2的变化研究

目的:探讨慢性HBV感染者特异性细胞毒性T淋巴细胞(specific cytotoxic T lymphocyte,CTL)及人类白细胞抗原-A2(human leucocyte antigen-A2,HLA-A2)的变化,并分析CTL与血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)水平和病毒载量的关系,以了解慢性HBV感染者特异性细胞免疫功能的状态。方法:采用HLA-A2限制的HBVcore18-27抗原表位肽五聚体(MHC Pentamers)法结合流式细胞技术,分析CHB组慢性乙型肝炎46例、LC组乙型肝炎肝硬化29例和NC组23例正常对照健康体检者,外周血HBV特异性CTL及HLA-A2的变化,并分析CTL与ALT水平和病毒载量的关系。结果:CHB组、LC组HLA-A2检出率均明显高于NC组;ALT水平和病毒载量与HBV特异性的CTL有一定的关系。结论:采用HLA-A2限制的HBVcore18-27抗原表位肽五聚体(MHC Pentamers)法结合流式细胞技术可以检测到低水平的HBV特异性CTL;HLA-A2是乙型肝炎肝硬化的易感基因之一;ALT水平和病毒载量与HBV特异性CTL有一定的关系。

人类免疫缺陷病毒感染与特异性细胞毒性T淋巴细胞反应

特异性细胞毒性T淋巴细胞是一种能直接杀伤病毒及抗细胞内感染的效应细胞。大多数细胞毒性T淋巴细胞为CD8细胞,其反应是控制人类免疫缺陷病毒感染的重要免疫反应,但细胞毒性T淋巴细胞不能完全清除人类免疫缺陷病毒,这与病毒在体内的高度变异及病毒攻击人体免疫系统导致免疫功能改变有关。

转基因表达HBV抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞受体

目的通过逆转录病毒介导HBV抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)的T细胞受体(TCR)转基因表达,初步观察其结合活性。方法从HLA-A2阳性急性乙肝患者外周血中诱导、分选、克隆和扩增HBV抗原特异性CTL;提取细胞RNA,用RT-PCR、5'-RACE和OVER-LAP PCR等方法获取TCR的α和β链编码基因;构建TCR重组逆转录病毒,介导特异性TCR分别在人Jurkat T细胞和HLA-A2阳性健康人CD8 T淋巴细胞上表达。结果从1例HLA-A2阳性急性乙肝患者样本中分别获得了2组TCR Vα、Vβ配对,分别命名为α21β13、α15β13,包装的重组逆转录病毒滴度为(1.5～5.0)×105IU/mL,用针对目标TCR的特异性Vβ链抗体(抗Vβ13 TCR-PE)和HLA-A2限制性表位特异性五聚体(pentamer)进行免疫荧光染色,重组TCR在T细胞表面获得表达:其中在Jurkat细胞上转入的Vβ13链表达细胞占1.06%～2.25%,在HLA-A2阳性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞分别占到1.03%～2.06%和1.05%～1.12%,在HLA-A2阴性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞均低于0.05%。结论通过逆转录病毒介导可以使HBV特异性CTL TCR获得转基因表达,具有结合HLA-A2限制性表位的活性。

白血病瘤苗对小鼠细胞毒性T淋巴细胞作用的研究

目的 探讨自制的一种白血病疫苗对C57BL/ 6小鼠细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)杀伤功能的影响。方法 建立白血病荷瘤小鼠模型 ,用自制的 3种不同的白血病疫苗进行预防或主动免疫治疗 ,用MTT比色法检测预防或治疗 2周、4周后小鼠CTL杀伤活性 ,并与对照组相比较。结果 ①随着白血病细胞在小鼠体内的生长 ,小鼠的CTL杀伤功能受到严重抑制。②灭活肿瘤细胞 +IFA +细胞因子 (rGM CSF +rIL 2 +rIL 6)的肿瘤疫苗在提高小鼠CTL的杀伤功能方面 ,优于灭活肿瘤细胞 +IFA肿瘤疫苗 ,而仅含灭活肿瘤细胞的疫苗作用不明显。结论 灭活肿瘤细胞 +IFA +细胞因子 (rGM CSF +rIL 2 +rIL 6)的肿瘤疫苗可以激活以CTL为代表的特异性细胞免疫功能 。

特异性细胞毒性T淋巴细胞体外检测方法的进展

抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞在免疫反应中起着重要作用,本文就近年来抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞反应的体外检测方法的原理及评价进行综述.

脑胶质瘤患者血清黑色素瘤相关抗原-A3特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫反应水平及临床意义

目的探讨脑胶质瘤组织中黑色素瘤相关抗原-A3(MAGE-A3)蛋白表达和甲基化状态,血清中特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答及临床意义。方法采用蛋白质印迹(Western blot)法和甲基化特异性聚合酶链反应(MSP-PCR)技术检测56例脑胶质瘤组织和15例正常脑组织中MAGE-A3蛋白表达和基因甲基化状态,采用Gultured酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测患者外周血单个核细胞(PBMC)中MAGE-A3特异性CTL免疫反应,并明确二者之间的关系,以及与患者临床特征的关系。结果56例脑胶质瘤组织中MAGE-A3蛋白的表达量为(2.26±1.09),明显高于15例正常脑组织中的(0.44±0.18)(P﹤0.01)。脑胶质瘤组织中MAGE-A3基因启动子甲基化率为55.36%(31/56),明显低于正常脑组织的100%(15/15)(P﹤0.01)。脑胶质瘤患者血清MAGE-A3特异性CTL免疫应答阳性率为33.93%(19/56),平均反应强度为(2301.70±560.33)SFC/106 PBMC。同一患者脑胶质瘤组织中MAGE-A3基因启动子甲基化状态与MAGE-A3蛋白高表达结果一致性一般(Kappa=0.679,P﹤0.01)。同一患者血清MAGE-A3特异性CTL免疫应答阳性与组织中MAGE-A3蛋白高表达结果一致性一般(Kappa=0.464,P﹤0.01)。脑胶质瘤患者血清中MAGE-A3特异性CTL免疫反应强度与组织中MAGE-A3蛋白表达量呈正相关(r=0.788,P﹤0.01)。不同肿瘤大小及临床分期的脑胶质瘤患者血清MAGE-A3特异性CTL免疫反应频率比较,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。结论脑胶质瘤组织中MAGE-A3基因启动子区DNA去甲基化导致MAGE-A3蛋白表达量升高,进而刺激机体产生MAGE-A3特异性CTL免疫应答反应,参与肿瘤生长和恶性进展。

IL-21对恒河猴SHIV特异性CD8~＋T细胞毒性效应的影响

目的探讨白细胞介素21(interleukin 21,IL-21)对SHIV特异性CD8+T细胞毒性效应的影响。方法定时采集16只SHIV感染恒河猴的外周血,应用实时荧光定量RT-PCR测定病毒载量,流式细胞仪测定CD8+T细胞绝对数,并且体外检测经IL-21刺激SHIV特异性CD8+T细胞后其IL-21R、CD107a及胞内穿孔素(perforin)的表达水平。结果体内实验结果表明外周血病毒载量和CD8+T细胞绝对数之间呈一定程度的负相关。体外实验结果表明SHIV特异性CD8+T细胞经IL-21刺激后其细胞表面表达的IL-21R显著上调,而且perforin+CD8+T细胞和CD107a+CD8+T细胞的百分比上升,同未经刺激的对照组相比具有统计学差异。结论 IL-21能够促进SHIV特异性CD8+T细胞的毒性效应。

细胞毒性T淋巴细胞在乙型肝炎中的作用研究

乙型肝炎病毒(HBV)感染后,决定病情严重程度及病程转归的一个主要因素是机体的免疫反应能力。由于患者体内抗病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在清除病毒方面发挥重要功能,CTL通过非细胞裂解机制控制HBV感染,本文就CTL在乙型肝炎中作用,针对HBV的主要组织相容性复合体Ⅰ类分子的CTL反应特异性,CTL的细胞效应机制以及慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL反应低下的原因等几方面的研究近况进行了综述。

不同免疫状态乙型肝炎患者外周血毒性T淋巴细胞的变化

引起乙型肝炎患者相应的毒性T淋巴细胞（CD8^＋CD45RA^＋CD28^-CTL,CTL）反应低下或无能的原因很多,包括免疫忽视、T细胞无反应性、特异性T细胞耗竭以及树突状细胞功能障碍和T辅助细胞2反应偏离等。有许多学者对于慢性乙型肝炎的严重程度与特异性CTL之间的关系进行了分析研究,

卵巢癌细胞系SKOV3冻融抗原诱导CTL特异性杀瘤效应的研究

目的探讨卵巢癌冻融抗原对T淋巴细胞的增殖作用及其诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在体外杀伤卵巢癌细胞的抗原特异性细胞毒性效应。方法采用免疫磁珠分离法(magneticactivatedcellsorting,MACS)分离纯化正常人外周血CD+3T细胞,体外以SKOV3卵巢癌细胞中提取的可溶性肿瘤抗原加以刺激。溴标法检测肿瘤抗原对T细胞增殖的影响;MTT法测定肿瘤抗原诱导的CTL体外杀伤卵巢癌细胞的能力;利用绒毛膜癌细胞抗原对比观察肿瘤抗原诱导CTL杀伤肿瘤细胞的抗原特异性。结果卵巢癌细胞抗原有很强的促进T淋巴细胞增殖的作用,且存在时间依赖性,在24h时促进作用最强。SKOV3抗原诱导的CTL在体外对SKOV3细胞的杀伤率为68.38%,显著高于它对JAR绒毛膜癌细胞的杀伤率(18.31%);而JAR细胞抗原诱导的CTL对JAR和SKOV3细胞的杀伤率分别为61.02%和14.79%,有显著的抗原特异性(P=0.0001)。结论卵巢癌细胞冻融抗原诱导的CTL在体外具有很强的增殖能力和抗原特异性杀伤卵巢癌细胞的作用。

基于LCK募集和活化的嵌合抗原受体T细胞的结构优化及其功能研究

目的 通过对二代嵌合抗原受体(CAR)进行淋巴细胞特异蛋白酪氨酸激酶(LCK)结构改造,探讨能否增强二代CD137 CAR-T细胞的活化水平及杀伤肿瘤细胞效率,为制备新型二代CAR-T细胞奠定基础。方法 利用基因工程技术,构建靶向人表皮生长因子受体-2(HER2)的CD137-LCK2 CAR和CD137-PYAP2 CAR的慢病毒载体,经慢病毒包装、感染活化T细胞后制备出CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞。采用流式细胞术、酶联免疫吸附实验、细胞毒性实验分别检测新构建的CAR-T细胞在活化分子CD137的表达水平、表型分布、分泌的细胞因子水平及对表达HER2的肿瘤细胞的杀伤效率。结果相较于二代CD137 CAR-T细胞,经过结构改造的靶向HER2的CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞能够上调活化分子CD137的表达、增加细胞因子IFN-γ的分泌、增强对靶细胞的杀伤能力,且均有统计学差异;同时能够维持在记忆状态、受抗原刺激后可迅速活化增殖分化。结论 靶向HER2的CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞有望比二代CD137 CAR-T细胞能更有效活化并发挥抗肿瘤效应。

IL-18在体外培养系统中诱导肿瘤快速杀伤效应及肿瘤特异性CTL

目的 应用rhIL 18在体外培养系统 (Coculturesysteminvitro ,CCs)中诱导快速肿瘤杀伤效应及诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CytotoxicTLymphocyte ,CTL)。方法 采用StemSepTM免疫磁性细胞分离法分离人外周血NK细胞、T细胞及树突细胞 (DCs) ,流式细胞仪分析细胞表型 ,12 5I UdR标记的细胞毒实验检测杀伤活性 ,ELISA方法检测IFN γ的产生量。结果 在CCs中 ,rhIL 18诱导出快速肿瘤杀伤效应 ,这种杀伤效应无抗原特异性、不受MHC限制 ,DCs和T细胞的存在与否对其无明显影响。在同一培养系统中 ,肿瘤抗原存在的条件下 ,96h后 ,rhIL 18能够诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应。结论 rhIL 18能够在体外培养系统中相继诱导肿瘤快速杀伤效应及肿瘤特异性CTL。

IFN-γ对体外培养系统中IL-18诱导的肿瘤特异性CTL杀伤效应的影响

目的:应用rhIL-18在体外培养系统(Coculture system in vitro,CCs)中诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic TLymphocyte,CTL),探讨IFN-γ在rhIL-18诱导的肿瘤特异性CTL产生过程及杀伤效应中的作用。方法:采用StemSepTM免疫磁性细胞分离法分离人外周血NK细胞、T细胞及DCs细胞,流式细胞仪分析细胞表型,125I-UdR标记的细胞毒实验检测杀伤活性,ELISA方法检测IFN-γ蛋白产生量,RT-PCR检测IFN-γmRNA表达含量。结果:在肿瘤抗原存在的条件下,IL-18在CCs中能够诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应;IL-18能够在肿瘤抗原刺激的CCs中诱导IFN-γmRNA的表达及IFN-γ蛋白的产生,并与IL-18的含量呈剂量依赖关系,在rhIL-18含量为100ng时,培养上清中IFN-γ为4410±210pg/ml。但加入抗IFN-γ抗体对rhIL-18诱导的肿瘤特异性CTL产生过程无明显影响,不能抑制IL-18诱导的这种肿瘤特异性CTL的杀伤效应。结论:IL-18能够在肿瘤抗原刺激的CCs中有效地诱导CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应,并诱导IFN-γ的产生,但其诱导肿瘤特异性CTL的产生过程及杀伤效应与IFN-γ无关。