非甲基化的CpG寡核苷酸对鼠巨噬细胞Toll样受体9及Th1/Th2类细胞因子分泌的影响

目的探讨非甲基化的CpG寡核苷酸(CpG-ODN)对鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7 Toll样受体9(TLR-9)的表达及Th1/Th2类细胞因子分泌的影响。方法体外培养小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7,置24孔培养板中,随机将细胞分为四组,分别为CpG-ODN组,Non-CpG-ODN组,CpG-ODN+氯喹组和对照组,分别添加CpG-ODN(0.3μg/ml),Non-CpG-ODN(0.3μg/ml),CpG-ODN+氯喹组(CpG-ODN和氯喹各0.3μg/ml),培养基。逆转录聚合酶链反应及Western blot检测24h后巨噬细胞TLR-9的表达,放免法及ELISA法检测刺激前后巨噬细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)及IL-12的表达水平。结果刺激24h后,巨噬细胞TLR-9mRNA的表达,CpG-ODN组与Non-CpG-ODN组比较,差异有统计学意义(t值为7.12,P<0.01);CpG-ODN组与对照组比较,差异有统计学意义(t值为8.04,P<0.01);CpG+氯喹组与Non-CpG-ODN组比较,差异有统计学意义(t值为4.25,P<0.05);CpG+氯喹组与对照组比较,差异有统计学意义(t值为5.58,P<0.01)。TLR-9蛋白,CpG-ODN组为1.35±0.18,高于Non-CpG(1.01±0.04)及对照组(0.91±0.10),差异有统计学意义(t值分别为3.21、3.67,P值均<0.05)。CpG-ODN+氯喹组为1.34±0.15,高于Non-CpG及对照组,差异有统计学意义(t值分别为3.71、4.10,P值均<0.05),而CpG-ODN组及CpG-ODN+氯喹组比较,差异无统计学意义(t值为0.10,P>0.05)。细胞上清液中TNF-α水平CpG-ODN组[(0.48±0.12)ng/ml]高于Non-CpG-ODN组[(0.29±0.23)ng/ml]、CpG-ODN+氯喹组[(0.32±0.24)ng/ml]和对照组[(0.29±0.19)ng/ml],差异有统计学意义(t值分别为2.84、2.38、3.25,P值均<0.05);IL-6,IL-12水平:CpG-ODN组分别为[(27.69±15.61)pg/ml和(48.59±25.17)pg/ml]与Non-CpG-ODN组分别为[(17.02±10.66)pg/ml和(59.58±32.89)pg/ml]、CpG-ODN+氯喹组分别为[(28.58±24.08)pg/ml和(41.30±13.17)pg/ml]和对照组分别为[(16.12±17.70)pg/ml和(61.54±39.69)pg/ml],差异无统计学意义(t值分别为1.94、0.75,P值均>0.05)。结论CpG-ODN刺激可引起鼠巨噬细胞TLR-9表达增高,Th1类细胞因子分泌增加。

靶向TLR9含非甲基化CpG寡核苷酸片段的合成及筛选

目的合成、筛选靶向Toll样受体-9(TLR9)含非甲基化磷酸胞苷酰(CpG)寡核苷酸片段。方法取系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血常规分离并培养外周血单一核细胞(PBMC),设计并人工合成含非甲基化CpG的寡核苷酸片段。实验分为A组(PBMC培养液中加入人工合成的寡核苷酸片段预处理后,再用小牛胸腺DNA作为免疫原刺激PBMC)、B组(仅用小牛胸腺DNA作为免疫原刺激PBMC)、C组(PBMC培养液中加入等量PBS,再用小牛胸腺DNA作为免疫原刺激PBMC)。用ELISA法检测各组抗dsDNA抗体。结果成功合成并筛选出含非甲基化CpG的寡核苷酸片段。A组抗dsDNA抗体浓度显著低于B组(P<0.05),但与C组近似(P>0.05)。结论成功合成并筛选出靶向TLR9含非甲基化CpG寡核苷酸片段。

具有免疫刺激活性的非甲基化寡核苷酸链的研究进展

富含非甲基化碱基CG的寡核苷酸链 (CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN) ,具有免疫刺激活性 .其骨架及侧翼核苷酸序列决定CpG ODN免疫效应的强度及特异性 .最近研究发现 ,通过对CpG ODN中核苷酸上的基团进行化学修饰 ,或改变侧翼核苷酸序列均能影响CpG ODN的免疫活性、种属及细胞特异性 .这对CpG

非小细胞肺癌11个肿瘤相关基因启动子CpG岛甲基化的研究

目的观测11个基因在非小细胞肺癌中的甲基化谱,探讨肺癌基因诊断的新途径。方法应用甲基化特异性的PCR(m ethyl-spec ific PCR,MSP)。方法检测甲基化率,回收产物测序。结果11个基因中有6个基因在癌组织中的甲基化率均>40%并且高于癌旁组织,6个基因的甲基化率分别是APC 61%,RASSF1 a 55%,p73 45%,p16 INK4 a 43%,CDH13 43%及RAR-β41%,>65岁组RASSF1 a、p16 INK4 a和RAR-β甲基化率高于≤65岁组;吸烟史组APC、RASSF1 a、p16 INK4 a和CDH13的甲基化率高于无吸烟史组;腺癌组APC、CDH13和RAR-β甲基化率高于鳞癌组,而鳞癌组p16 INK4 a甲基化率高于腺癌组;RASSF1 a和p16 INK4 a甲基率随TNM临床分期而逐渐增加。结论6个基因甲基化率的发生具有肿瘤特异性,并且相关基因的甲基化与NSCLC患者的病理生理密切相关,我们的研究为早期诊断NSCLC提供帮助。

非甲基化CG的寡脱氧核苷酸链对慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能的影响(英文)

目的:探讨非甲基化CG的寡脱核苷酸链(CPGODN)对慢性乙型肝炎(CHB)患者树突状细胞(DCs)功能的影响。方法:对10例慢性乙型肝炎患者,10例HBV携带者及10例健康对照者外周血来源DCs进行体外培养。应用流式细胞技术检测DCs的表面分子HLA-DR,CD80和CD86的表达,ELISA检测DCs培养上清中IL-12水平,并在电镜下观察DCs的改变。结果:体外培养第6天的DCs,加入CpGODN继续培养24h后,透射电镜下观察,与完全培养基对照组DCs相比,其表面的空起丰富、增粗,粗面内质网增多,空泡减少甚至消失。流式细胞仪分析显示,CpGODN刺激组CD80,CD86及HLA-DR在CHB患者、HBV携带者及正常人DCs上的表达阳性率均较完全培养基对照组明显升高(P<0.05)。CHB患者、HBV携带者及正常人DCs均用完全培养基培养时,CHB患者及HBV携带者DCs上的HLA-DR,CD86和CD80的表达阳性率较正常人明显下降(P<0.05),但CHB患者和HBV携带者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。CHB患者、HBV携带者及正常人DCs均用CpGODN刺激时,CHB患者DCs上的HLA-DR和CD86表达阳性率较HBV携带者及正常人明显下降(P<0.05),但HBV携带者和正常人之间比较却无统计学差异(P>0.05);CHB患者和HBV携带者DCs的CD80表达阳性率较正常人明显下降(P<0.05),但CHB患者和HBV携带者之间比较却无统计学差异(P>0.05)。ELISA检测发现CpGODN刺激组DCs分泌IL-12的水平无论在CHB患者、HBV携带者及正常人均较完全培养基对照组明显升高(P<0.05)。无论是完全培养基培养还是CpGODN刺激,CHB患者及HBV携带者DCs分泌IL-12较正常人明显下降(P<0.05),但CHB患者和HBV携带者之间比较却无统计学差异(P>0.05)。结论:CpGODN能够明显促进CHB患者外周血DCs成熟,为CpGODN治疗CHB提供了实验基础。

甲基化CpG岛扩增联合代表性差异分析方法在筛查人非小细胞肺癌组织中高甲基化修饰序列的应用

目的探讨甲基化CpG岛扩增联合代表性差异分析(MCA/RDA)方法在筛查人非小细胞肺癌(NSCLC)组织中高甲基化修饰序列的应用。方法以92对NSCLC和癌旁对照组织DNA为研究对象,应用MCA/RDA方法筛查肺癌组织DNA中高甲基化修饰的CpG岛序列。应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和甲基化特异性PCR(methylation-sensitive PCR,MSP)技术,分析胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-4)基因启动子区CpG岛的甲基化修饰与基因表达的相关性。结果获得5个经Slot Blot验证在肺癌组织中高甲基化修饰的CpG岛序列(IGFBP-4、KLK10、ADAM23、GADD45G和DUOX1)。甲基化抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine处理NSCLC细胞可明显上调IGFBP-4基因的表达。在41例(44.6%)癌组织中检测到IGFBP-4表达水平显著低于癌旁对照组织。47例(51.1%)癌组织检测到IGFBP-4高甲基化显著高于癌旁组织的检出率(16.3%,15/92;P<0.001)。IGFBP-4高甲基化与基因表达呈负相关(r=-0.396,P<0.001)。IGFBP-4高甲基化与TNM分期(P=0.013)和淋巴结转移(P=0.022)相关。结论应用MCA/RDA方法筛查到5个在NSCLC组织中高甲基化修饰的CpG岛序列,并证实IGFBP-4启动子区CpG岛的高甲基化可能通过抑制基因的表达参与了NSCLC的发生。

含有非甲基化CpG的双歧杆菌DNA对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响

目的:探讨双歧杆菌DNA对小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)成熟的影响.方法:纯化提取双歧杆菌DNA,并鉴定DNA制品CpG基序甲基化程度;FACS检测BMDC的吞噬功能和表面标志分子,ELISA法检测BMDC分泌细胞因子水平,3H-TdR掺入法检测T淋巴细胞增殖能力.结果:双歧杆菌DNA诱导24 h后BMDC高表达Ia,CD40,CD86和CD11 c分子,明显增加IL-6,IL-12(p40),TNF-α的分泌,显著增强同种异体和自体T细胞增殖的能力.结论:双歧杆菌DNA能够促进BMDC成熟,增强BMDC的抗原提呈能力.

非小细胞肺癌CDH13及DAPK基因CpG岛甲基化的研究

目的探讨非小细胞肺癌患者抑癌基因CDH13及DAPK基因CpG岛甲基化情况及其临床意义。方法采用甲基化特异性-PCR方法检测40例非小细胞肺癌患者(肺癌组)和30例肺良性病变患者(肺良性病变组)的抑癌基因CDH13及DAPK的Cp G岛甲基化的情况。结果肺癌组织CDH13、DAPK基因CpG岛甲基化率分别为47.5%(19/40)、40.0%(16/40),癌旁组织分别为27.5%(11/40)、30.0%(12/40),肺良性病变组织均为0。癌组织、癌旁组织CDH13、DAPK的CpG岛甲基化率均明显高于良性病变组(P<0.05),但癌组织与癌旁组织间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。鳞癌与腺癌组织CDH13、DAPK的CpG岛甲基化率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论非小细胞肺癌组织存在CDH13、DAPK的CpG岛甲基化,其与非小细胞肺癌发生发展有着密切关系。

TRIM38非CpG岛DNA甲基化与胶质瘤异柠檬酸脱氢酶突变的关系研究

目的探讨TRIM38基因非CpG岛DNA甲基化与胶质瘤异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因突变之间的关系。方法利用中国胶质瘤基因组图谱计划(CGGA)数据库的多组学数据和临床资料,比较在IDH野生型或突变型的胶质瘤中,TRIM38非CpG岛DNA甲基化的改变模式以及与基因表达和临床预后的关系。结果共纳入CGGA胶质瘤325例及非肿瘤对照脑组织(NTB组)11例,分析发现IDH野生型胶质瘤TRIM38非CpG岛DNA甲基化和基因表达,相对NTB组分别发生低甲基化(P=0.000)和高表达(P=0.007),且两者之间呈负相关(P=0.017)。生存分析显示,TRIM38非CpG岛DNA甲基化水平与IDH野生型肿瘤的预后有关(P=0.061)。结论IDH突变可能通过限制TRIM38基因非CpG岛DNA低甲基化介导的肿瘤促癌基因表达上调,为IDH突变相关的胶质瘤提供“保护作用”。

TRIM38基因非CpG岛DNA甲基化与胶质母细胞瘤临床预后的关系

目的探讨免疫基因TRIM38非CpG岛DNA甲基化在胶质母细胞瘤(GBM)中改变模式和临床意义。方法利用公共数据库,比较TRIM38甲基化在GBM与非肿瘤脑组织(NTB)中的差异程度,并通过统计分析探讨该基因甲基化水平与基因表达、病人预后、生物学背景的关系。结果纳入3组GBM(共509例)和3组NTB(共37例)样本。TRIM38基因非CpG岛DNA甲基化位点在GBM中呈低甲基化改变(P<0.05),而其基因表达呈现高表达改变(P<0.05),并且甲基化与基因表达呈显著负相关(P<0.05)。TRIM38低甲基化病人生存时间明显短于高甲基化组(P<0.05),甲基化水平是独立的预后影响因子(P<0.05)。TRIM38低甲基化GBM样本可能富集免疫调节及Toll样受体通路相关的基因簇。结论 TRIM38可能在GBM中通过非CpG岛低甲基化介导的基因异常表达上调,参与肿瘤发生、发展;TRIM38非CpG岛甲基化可能作为指导GBM预后评价的潜在生物标记物;TRIM38甲基化导致的预后差异很可能与Toll样受体通路及免疫调节的差异有关。

MMP7基因非CpG岛DNA甲基化对胶质母细胞瘤预后的评估

目的本研究以胶质母细胞瘤(GBM)为疾病背景,以促癌基因MMP7为研究对象,以期从个体基因角度揭示非CpG岛DNA甲基化在肿瘤疾病中的意义。方法利用公共数据库数据,比较MMP7基因非CpG岛DNA甲基化在GBM与非肿瘤脑组织(NTB)中的差异程度,并通过统计分析该基因非CpG岛DNA甲基化水平与基因表达、患者预后、分子亚型及生物学背景的关系。结果本研究共纳入3组GBM样本及3组NTB样本,分析发现位于MMP7基因非CpG岛区域的CpG位点(cg25511807)在GBM中发生显著的低甲基化改变,而其基因表达水平呈现高表达状态。MMP7在不同分子亚型的甲基化和基因表达也呈现相似的模式。关联分析未发现其CpG位点甲基化水平与基因表达水平呈强相关性。生存分析表明MMP7非CpG岛DNA低甲基化患者总体生存时间(OS)显著短于高甲基化组,多因素Cox回归分析表明MMP7甲基化分组是独立于患者年龄、IDH1突变及MGMT启动子CpG岛甲基化状态的预后因子。生物信息学分析表明MMP7低甲基化的肿瘤样本可能富集肿瘤耐药和血管生成相关的功能基因簇。结论本研究以MMP7基因非CpG岛DNA甲基化在GBM中改变模式、与基因表达、临床预后及生物学背景的关系为例,从个体基因角度,强调基因非CpG岛区域DNA甲基化在肿瘤疾病中重要价值和临床意义。

胶质母细胞瘤FMOD基因非CpG岛DNA甲基化水平与病人预后的关系

目的探讨纤调蛋白(FMOD)基因非CpG岛区域DNA甲基化在人脑胶质母细胞瘤(GBM)中的改变模式以及与基因表达、临床预后的关系。方法检索国癌症基因组图谱计划数据库(TCGA)和国国立卫生院下属基因表达数据库(GEO)下载人脑GBM组织基因表达芯片GSE36278、GSE22891及GSE50923。分析FMOD基因的CpG探针[cg26987645和cg03764585,均来自人类全基因组DNA甲基化芯片(Infinium HumanMethylation 27 k和450 k BeadChips),均位于非CpG岛区域(www.illumina.com)]β值(与甲基化水平呈正相关)。结果与非肿瘤组织相比,GBM组织FMOD基因非CpG岛区域探针cg26987645和cg03764585的β值均显著下降,提示GBM组织FMOD基因发生特异性低甲基化。将CpG岛区域探针cg26987645和cg03764585的β值与mRNA数据进行关联分析发现,DNA甲基化水平与FMOD基因表达水平呈显著负相关(P<0.001)。Cox回归分析显示,随FMOD基因CpG岛区域探针cg26987645和cg03764585的β值增加,GBM病人生存期显著延长(P<0.05)。FMOD基因非CpG岛cg03764585和cg26987645探针分析显示,非G-CIMP亚型病人甲基化水平较G-CIMP亚型病人明显降低(P<0.05),而FMOD基因表达水平明显增高(P<0.05)。结论本文结果提示,GBM组织FMOD基因非CpG岛区域呈低甲基化表现,与FMOD基因表达和病人生存预后均呈明显负相关。

非小细胞肺癌患者血浆氧化应激水平和Klotho启动子甲基化分析

目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血浆氧化应激损伤水平和Klotho蛋白启动子甲基化状态及临床意义。方法:选择66名在四川省人民医院确诊为NSCLC的患者,另选50名健康人群作为对照组,分别采集其血浆。血浆超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和过氧化氢酶(catalase,CAT)水平采用试剂盒检测。qPCR和Western blot检测血浆Klotho的表达。Klotho表达量与氧化应激的相关性采用Pearson相关性分析。甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测Klotho甲基化水平。CpG岛甲基化率采用焦磷酸盐测序法。结果:相对于对照组[(94.56±16.40)m U/L],观察组SOD含量[(79.86±18.24)mU/L]明显降低(t=4.487,P=0.000),观察组MDA水平[(2.87±2.26)pg/mL]与对照组[(2.52±1.06)pg/mL]无统计学差异(t=1.675,P=0.097),观察组CAT水平[(18.50±4.62)U/mg]与对照组[(25.26±3.54)U/mg]相比明显降低(t=8.605,P=0.000)。观察组(0.66±0.16)比对照组(1.04±0.10)血浆Klotho基因(t=14.93,P=0.000)降低;观察组(0.70±0.20)比对照组(1.04±0.10)血浆Klotho蛋白表达(t=10.92,P=0.000)降低,且Klotho蛋白表达量与SOD水平(r=0.768,P=0.000)和CAT水平(r=0.708,P=0.000)呈正相关。观察组Klotho启动子CpG岛甲基化水平升高。结论:Klotho甲基化可能是NSCLC患者血浆氧化应激状态的一个临床标志物。

C7ORF41在非酒精性脂肪肝中甲基化功能研究

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是众多代谢性疾病的共同病理基础,其发病机制尚未完全阐明,且临床上缺乏有效的治疗方法。大量研究表明,DNA甲基化在调控NAFLD相关代谢性疾病的发病机制中发挥重要作用。前期研究发现,C7ORF41参与非酒精性脂肪肝的发生,然而其作用机制需进一步探究。本研究采用棕榈酸(palmitate acid,PA)诱导的L02、HepG2细胞作为脂肪肝研究模型,探究C7ORF41基因启动子区DNA甲基化在脂肪肝中的作用。结果显示,C7ORF41在PA诱导的脂肪肝中表达明显降低(P<0.01),并且其启动子区CpG岛甲基化水平显著升高(P<0.01)。此外,DNA甲基转移酶抑制剂5-AzadC能够逆转PA诱导的C7ORF41低表达及脂质积累。进一步的研究发现,脂肪肝中DNMT3a表达增多,用siRNA将其敲低后能够逆转C7ORF41的低表达,表明脂肪肝发生过程中,DNMT3a介导C7ORF41启动子区甲基化是导致其表达降低的原因之一。

DNA甲基化与肺癌临床关系研究进展

DNA异常甲基化是一种表观遗传学改变，与肿瘤临床关系是目前肿瘤分子生物学研究的热点，常发生在启动子区的CpG岛，与肺癌发生密切相关，是肺癌发生中的早期事件。DNA甲基化是非小细胞肺癌（NSCLC）诊断、分期及治疗预后特异性较强的标识物。最近研究表明某些基因甲基化发生在CpA，CpC，CpT二核苷酸区，即non-CpG岛。

含CpG元件的寡脱氧核苷酸可在体外抑制乙肝病毒复制

据医学空间网9月6日报道（原载Immunol Lett 2005 Aug 13），在特定位点含有非甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（CpG元件）的寡脱氧核苷酸（ODNs）是有力的免疫激活剂，还可诱导若干Th1类免疫调节因子的生成。动物试验提示，CpG ODNs有望作为疫苗佐剂及免疫保护因子。

CpG ODN核心序列改变对其生物学活性的影响

目的:观察含CpG基序寡核苷酸(CpG ODN)核心序列改变后对其细胞内化和免疫活性的影响。方法:人工合成6-FAM标记的CpG ODN,将其核心序列CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)甲基化(mCpG ODN)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)顺序颠倒(GpC ODN),在RAW264.7细胞培养体系中加入不同的ODN后,应用流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察ODN的细胞内化与定位,ELISA法检测ODN对细胞释放TNF-α的影响。结果:CpG ODN核心序列的改变不影响其在细胞内的聚集,激光共聚焦术检测发现6-FAM ODN被内化进入RAW264.7细胞,绿色荧光小体呈散点状分布于细胞中;胞嘧啶甲基化后,mCpG ODN促细胞释放TNF-α的作用显著降低(P<0.01),仅保留部分刺激活性,但是GpC ODN几乎丧失了促细胞释放TNF-α的作用。结论:CG序列对CpG ODN的生物活性至关重要,胞嘧啶C甲基化不影响CpG ODN在细胞内的定位,但能部分抑制CpG ODN的免疫活性。

CpG ODN对小鼠哮喘模型气道炎症及信号转导子和转录激活子6(STAT6)表达的影响

目的:研究寡核甘酸免疫刺激序列(CpGoligonucleotides,CpG ODN)对急性支气管哮喘小鼠气道炎症及信号转导子和转录激活子6(STAT6)表达的调控作用。方法:将32只雄性BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组、地塞米松干预组和CpG ODN干预组,建立急性哮喘气道炎症模型。对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞总数、嗜酸粒细胞(EOS)分类计数;取左叶肺组织切片做HE染色观察气道和肺组织炎症改变;用免疫组织化学法检测气道上皮组织中STAT6表达。结果:哮喘组小鼠BALF中细胞总数、EOS绝对值显著高于对照组(P<0.05),地塞米松组和CpG ODN组上述炎症细胞计数比哮喘组明显减少(P<0.05)。HE染色示地塞米松组和CpG ODN组小鼠肺组织炎症程度较哮喘组减轻。STAT6在气道上皮细胞表达,哮喘组气道上皮细胞中STAT6表达较对照组增强,地塞米松组和CpG ODN组STAT6表达与哮喘组比较有明显减少(P<0.05),较对照组增加。支气管上皮细胞STAT6蛋白表达与BALF中的EOS绝对值呈显著正相关(r=0.748),而地塞米松组和CpG ODN组之间的作用无统计学差异(P>0.05)。结论:应用地塞米松和CpG ODN均可在一定程度上减轻哮喘小鼠的气道炎症,CpGODN可能通过下调肺组织中STAT6蛋白的过度表达,从而抑制依赖于STAT6/IL-4通路的急性气道炎症,减轻哮喘的症状。