红豆杉细胞非甲羟戊酸途径关键酶基因dxr的克隆与分析

近几年的研究表明 ,非甲羟戊酸途径可能是紫杉醇合成的主要途径 ,通过对各种不同来源的非甲羟戊酸途径关键酶 5_磷酸脱氧木酮糖还原异构酶 (DXR)基因同源区域进行比较 ,设计出简并引物 ,利用RT_PCR技术从中国红豆杉 (Taxuschinensis)悬浮细胞中扩增出 5 35bp的基因片段。同源序列比对发现 ,推断的蛋白质序列与Arabi dopsisthaliana (Q9XFS9)、Menthaxpiperita (Q9XES0 )、Synechococcuselongatus (Q8DK30 )、Synechocystissp .PCC 6 80 3(Q5 5 6 6 3)、Nostocsp .PCC 71 2 0 (Q8YP4 9)、Synechococcusleopoliensis (Q9RKT1 )的一致性分别达到 95 %、94 %、80 %、78%、78%和 73%。结合蛋白质保守区、特征区以及进化树分析 ,证实该基因确为dxr基因 。

类异戊二烯非甲羟戊酸代谢途径的分子生物学研究进展

近期发现的类异戊二烯非甲羟戊酸代谢途径是类异戊二烯化合物生物合成的另一途径。文章对该代谢途径的分子生物学研究进展进行了综述。重点介绍非甲羟戊酸代谢途径的发现和 5 -磷酸脱氧木糖合成酶、5 -磷酸脱氧木糖还原异构酶。

磷甘霉素和洛伐它汀处理对中国红豆杉悬浮培养细胞生物合成紫杉醇的影响

采用非甲羟戊酸途径抑制剂磷甘霉素和甲羟戊酸途径抑制剂洛伐它汀对中国红豆杉悬浮细胞培养物进行处理。在添加和未添加茉莉酸甲酯诱导的情况下,前者使紫杉醇产量减少了2/5和1/5,后者使紫杉醇产量减少了1/6和1/10,表明两种途径对紫杉醇的生物合成都具有贡献,其中非甲羟戊酸途径贡献较大;通过定量PCR技术分别检测两条途径的关键酶5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)mRNA水平的变化,发现两种抑制剂都能够激活hmgr和dxr的转录,表明两种代谢途径之间存在协同作用,共同为紫杉醇的生物合成提供前体。

2,4-二硝基苯肼柱前衍生高效液相色谱法测定1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶稳态动力学参数

利用含羰基化合物与2,4-二硝基苯肼在酸性条件下反应得到的产物腙对紫外-可见光有吸收的特性,采用柱前衍生高效液相色谱法测定了1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶稳态动力学参数。酶反应产物1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸在碱性磷酸酶的作用下生成去磷酸化产物1-脱氧-D-木酮糖,然后与2,4-二硝基苯肼衍生成腙。衍生化反应的适宜条件为:HClO4浓度为1.5%,反应温度37℃,反应时间60 min,2,4-二硝基苯肼与1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的摩尔比为6∶1。色谱条件:0～17 min,40%～80%甲醇;18～20 min,40%甲醇。结果表明,本方法具有较高的灵敏度和良好的线性关系,1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的检出限为1.0 mg/L,在0.005～1.0 g/L范围内线性相关系数为0.999,相对标准偏差小于5.0%(n=3),标准回收率为102.22%。用本方法测得的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶稳态动力学参数Km、Vmax和Kcat与文献报道一致。