α,β-聚[(N-羟丙基/氨乙基)-DL-天冬酰胺-CO-L-赖氨酸]作为潜在的非病毒性基因载体的研究

实验研究了DL-天冬氨酸和L-赖氨酸通过不同的比例合成的一系列聚[DL-天冬氨酸-CO-L-赖氨酸](PAL),经过1H-NMR、FT-IR、X-Ray方法进行表征后确认了结构并证明该类聚合物有较好的规律性。PAL开环后合成α,β-聚[(N-羟丙基/氨乙基)-DL-天冬酰胺-CO-L-赖氨酸](PHAAL),通过对PHAAL在磷酸缓冲液(pH=7.4,0.01M)和酶(木瓜蛋白酶,胰蛋白酶)溶液中降解实验的研究,结果显示该类聚合物具有良好的降解能力。利用MTT方法测PHAAL在Hela,ECV-304,Bcap37细胞中的细胞毒性,实验结果表明PHAAL的细胞毒性较低。利用含溴乙啶(0.25μg/ml)的琼脂糖凝胶(1.0%,w/v)电泳检测PHAAL的DNA结合能力,发现赖氨酸聚合比例高的PHAAL结合DNA的能力较强。综合各种实验结果分析,PHAAL是一类可作为非病毒性基因载体的聚氨基酸类高分子材料。

非病毒性基因载体的合成研究

基因治疗是一种有效的治疗先天性遗传性疾病以及后天获得性疾病的手段。它通过激发细胞的生物活性或者抑制细胞非正常的功能来治疗或者预防疾病的发生,例如细胞的基因紊乱,细胞的无序增殖。目前基因治疗所面临的问题是缺乏有效的基因递送载体。基因载体主要分为病毒性基因载体和非病毒性基因载体。与病毒性基因载体相比,非病毒性基因载体具有毒性小、安全性高、易于制备、能够荷载分子量大的DNA等优点。本文综述了非病毒性基因载体的合成研究进展。

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组慢病毒载体构建和鉴定

为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDV E0基因序列(AJ133739.1),构建包含Ig K信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-Ig K-E0重组质粒和不含信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-E0重组质粒,将其采用PEI方法分别转染HEK-293T细胞包装慢病毒,并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行western blot检测蛋白表达。通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因正确整合至慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达。本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究奠定基础。

牛病毒性腹泻病毒石河子株E2基因的克隆及其表达载体的构建

应用RT-PCR方法从牛病毒性腹泻病毒(BVDV)新疆石河子分离株中扩增了E2基因,命名Shihezi 148(GenBank登录号:EU159699),扩增序列分析结果表明:Shihezi 148 E2基因长度为1121 bp,编码373个氨基酸残基;同源性分析表明,Shihezi 148与澳大利亚Bega株E2基因核苷酸同源性为88.32%,与中国changchun 184株的同源性为74.42%;通过基因重组技术构建了去除C端跨膜区的截短E2基因的原核表达载体pProEX HTa-E2和包括信号肽和全长E2蛋白的真核重组质粒pVAX1-E2。经过PCR、酶切及测序结果表明pProEX HTa-E2和pVAX1-E2重组表达载体构建成功。

牛病毒性腹泻病毒gP48基因pET32a原核表达载体的构建

为了研究牛病毒性腹泻病毒gP48基因在大肠杆菌中的原核表达,试验以pMD18-T-gP48质粒为模板,经PCR扩增gP48基因的编码序列,克隆入原核表达载体pET32a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行双酶切鉴定,诱导表达重组蛋白并进行SDS-PAGE电泳以及Western-blot鉴定。结果表明:重组质粒gP48-pET32a经PCR及酶切测序鉴定,质粒构建正确;重组质粒经诱导表达后,可表达出分子质量约为46 ku的蛋白。

以聚乙烯亚胺为骨架的非病毒基因载体的构建及其转染大鼠肝细胞的研究

目的 构建交联聚乙烯亚胺（Polyethylenemine,PEI）衍生物PEI-Bu,研究其对大鼠肝细胞系BRL-3A的细胞毒性和转染效率.方法 以PEI 800Da为骨架,1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂制备聚合物PEI-Bu,用凝胶渗透色谱法（GPC）测定分子量,动态光散射法（DLS）测定PEI-Bu/pDNA复合物的粒径和Zeta电位,琼脂糖凝胶电泳考察其复合质粒DNA的能力.MTT法榆测PEI-Bu对BRL-3A的细胞毒性,以荧光素酶质粒作为报告基因,测定PEI-Bu/pDNA复合物在BRL-3A细胞中的转染效率.结果 GPC 测定分子量为Mw4289Da,多分散指数1.31,复合物的粒径为138-16lnm,Zeta电位为2.4-4.3mV,凝胶电泳表明在质量比大于1时 PEI-Bu 具有复合DNA的能力,在同一浓度下PEI-Bu的细胞的毒性小于PEI 25kDa （p〈0.01）,PEI-Bu/pDNA在质量比为5时达到最高转染效率,高于PEl25kDa （p〈0.01）.并与Lipofectamine2000 相当 （P〉0.05）.结论 PEI-Bu对BRL-3A 细胞是一种低细胞毒性、高转染效率的非病毒基因载体,在肝细胞基因治疗领域中具有潜在的应用前景.

新型非病毒纳米基因载体PEI-β-CyD对软骨细胞和骨髓间充质干细胞转染有效性评估

目的评估新型非病毒纳米基因载体聚乙烯亚胺-β-环糊精(PEI-β-CyD)对软骨细胞系C5.18和骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2转染的有效性。方法体外培养软骨细胞系C5.18和骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2,MTT法观察并比较PEI-β-CyD和相对分子质量为25 000的聚乙烯亚胺(PEI25KDa)对C5.18细胞和C3H10T1/2细胞的细胞毒性。在不同的N/P(载体有效氮含量/外源基因有效磷含量)复合条件下,利用PEI-β-CyD和PEI25KDa分别转染C5.18细胞和C3H10T1/2细胞,倒置荧光显微镜结合流式细胞仪分析转染效率。结果 PEI-β-CyD对C5.18细胞和C3H10T1/2细胞的细胞毒性均小于PEI25KDa。PEI-β-CyD与PEI25KDa对C5.18细胞的转染效率比较,差异无统计学意义(P>0.05);PEI-β-CyD对C3H10T1/2细胞的转染效率显著高于PEI25KDa(P<0.05)。结论 PEI-β-CyD对于软骨细胞系C5.18及骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2是一种低毒有效的非病毒纳米基因载体,在软骨组织工程和细胞治疗研究及应用领域具有良好的开发前景。

聚乙烯亚胺非病毒基因载体结构修饰研究进展

聚乙烯亚胺(PEI)作为最经典的非病毒基因载体之一,由于其高转染效率,在基因递送领域受到极大的关注,但其毒性限制了聚乙烯亚胺的应用。本文综述了对聚乙烯亚胺进行不同的结构修饰,如多糖修饰、聚乙二醇(PEG)修饰和低分子聚乙烯亚胺衍生物等,以实现在不显著降低转染效率的前提下减少细胞毒性。

基因治疗的病毒性载体研究

基因治疗通常是指把遗传物质(DNA或RNA)引入到患者的细胞中,以达到治疗疾病的目的.1990年9月,美国科学家Anderson博士等人进行了首例基因治疗的临床试验.到目前为止,全世界范围内已经批准进行了400多个临床试验方案.1991年,复旦大学的薛京伦教授研究小组进行了我国第一例基因治疗临床试验.人类基因组的DNA序列工作框架图的完成,标志着功能基因组时代的到来,虽然目前基因治疗在有效性、可操作性和安全性等方面面临着不少问题,但我们有理由相信,在不远的将来必会产生突破性的进展并带来具有深远意义的医疗革命.

牛病毒性腹泻病毒长春分离株P125基因的克隆与序列测定

以MDBK细胞培养致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)NCD毒株 ,采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA ,并根据BVDVNADL参考株序列设计合成的 1对引物 (W 1与W 2 ) ,进行反转录PCR (RT PCR) ,扩增出P12 5基因区约40 0bp的片段。经 pGEM T载体连接后克隆、测序 ,并与已发表的NADL、Osloss、SD 1、184、D、H、Yak等BVDV毒株序列进行比较。结果表明 :NCD株P12 5基因区无插入或缺失变异 ,但存在着核苷酸的替换 ;经聚类分析初步认为NCD株属于Ⅰa型。NCD株与长春 184、H株核苷酸序列差异较大 ,而亲缘关系较近 。

某地区非典型趋化因子受体1多态性与丙型病毒性肝炎易感性的研究

目的调查大连地区人群非典型趋化因子受体1多态性与丙型肝炎病毒(HCV)易感性的相关性。方法选取2015年4月至2015年12月就诊于大连市传染病医院的231例抗-HCV及丙型肝炎病毒核酸(HCV-RNA)阳性的HCV感染者作为观察组,选取同期239名无血缘关系的健康献血者作为对照组。使用TaqMan-MGB探针实时定量PCR技术对两组样本进行非典型趋化因子受体1基因分型。结果两组FY*A/FY*A、FY*B/FY*B和FY*A/FY*B的基因型分布与FY*A、FY*B的等位基因分布未发现显著差异。结论非典型趋化因子受体1的多态性不能直接影响HCV的易感性。

兽用病毒性基因重组疫苗的研究进展

1796年,EdwardJenner用感染牛痘病毒的母牛病料组织第一个制备了天花疫苗,但直到19世纪40年代中期,Negri发明了在牛和绵羊皮肤上制造天花疫苗的技术之后,疫苗才逐步推广。在20世纪50年代中期,采用鸡胚和组织培养细胞来生产病毒疫苗,直到70年代,重组DNA技术的发展对疫苗生...

非骨髓清除性异基因外周血造血干细胞移植(NST)治疗恶性血液病的初步临床研究

目的 探讨NST治疗恶性血液病的效果及毒性。方法 急性粒细胞白血病未分化型 (AML -M1)、慢性髓细胞白血病 (CML)、骨髓增生异常综合征 (MDS -RA)患者各 1例 ,供体为其HLA配型完全相合的同胞。供体动员方案 :G -CSF 30 0 μg/ 12h× 5d后分离采集外周血干细胞。所获CD34 + 细胞数分别为 6 .36× 10 6/kg、9.72×10 6/kg、6 .6 2× 10 6/kg ;单个核细胞数 (MNC)分别为 14.0× 10 8/kg、10 .47× 10 8/kg、8.5 8× 10 8/kg ;T细胞总数分别为 8.80× 10 8/kg、7.12× 10 8/kg、5 .6 7× 10 8/kg ;CFU -GM数分别为 16 2个 / 2× 10 5MNC、184个 / 2× 10 5MNC、182个 / 2× 10 5MNC。预处理方案 :Fludarabine:30mg/m2 ·d-1× 6d ,Bu :4mg/kg·d-1× 2d ,ALG :12mg/kg·d-1× 4d ,Ara-C :10 0mg/m2 ·d-1× 3d。单用环胞菌素 (CSA)预防移植物抗宿主病 (GVHD)。移植后未用造血生长因子。结果 患者均能顺利完成预处理方案 ,没有严重并发症出现。移植后 10～ 13d造血重建。未发生急性GVHD。随访10 0～ 16 0d ,血常规、骨髓象均正常 ,1例发生肝脏型慢性GVHD。结论 NST能有效治疗恶性血液病 ,方案相关毒性小 ,适用范围广 ,移植相关并发症少 ,造血重建迅速。

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p7 的克隆和原核表达纯化

为了对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)p7蛋白进行表达和纯化,本研究开展p7基因克隆、原核表达载体构建和原核表达分析。依据GenBank数据库中BVDV毒株NADL的p7基因设计引物,以BVDV NADL的cDNA为模版,PCR扩增p7基因,测序鉴定后将其克隆至pCold-MBP原核表达载体中;优化蛋白诱导的IPTG浓度,过夜低温诱导p7蛋白表达,并使用Ni-TED琼脂糖树脂进行蛋白纯化。结果显示,成功克隆p7基因,与GenBank数据库中p7基因同源性100%;成功构建pCold-MBP-p7载体;IPTG浓度为1.2mM时诱导效果最佳;成功表达和纯化MBP-p7融合蛋白。结论:诱导表达纯化获得MBP-p7融合蛋白,为后续构建p7蛋白的多克隆和单克隆抗体提供重要的材料和平台。

牛病毒性腹泻病毒HB-bd毒株E2基因的克隆表达及免疫原性分析

为了研究牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的免疫原性,试验采用PCR技术扩增牛病毒性腹泻病毒HB-bd毒株去除跨膜区的E2基因,将获得的s E2基因克隆到p ET20b载体构建重组质粒p ET20bs E2,并转化大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞及诱导表达,应用SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA对表达产物进行分析,取纯化的表达产物加等量佐剂免疫家兔,观察免疫效果。结果表明:s E2基因得到了高效表达,表达的重组蛋白分子质量约为37.0 ku,表达产物能诱导免疫家兔产生高效价抗BVDV抗体。说明表达产物s E2蛋白具有良好的免疫原性。

BVDV非结构蛋白NS4B的结构分析及其蛋白表达与鉴定

NS4B是牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的非结构蛋白,为研究BVDV在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,对ns4b进行了结构分析、表达载体构建及蛋白表达。采用Prot-Param、TExpasy和SignalP-4.1等软件分析NS4B蛋白的氨基酸组成、疏水性和空间结构。根据Genebank上公布的BVDVns4b基因序列设计引物,利用PCR方法获得ns4b基因片段,连接到p3×Flag-CMV10表达载体上,构建重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,经双酶切与测序鉴定正确后,将p3×FlagCMV10-ns4b转染到HEK-293T细胞中,利用Western blot检测NS4B蛋白的表达。结果表明BVDV NS4B蛋白分子量为38.4 kDa,不存在信号肽,有49个磷酸化位点和6个糖基化位点,是一种主要由α-螺旋和无规则卷曲结构组成的疏水性稳定蛋白。成功构建了重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,并且p3×Flag-CMV10-ns4b在HEK-293T细胞中成功表达,为今后研究NS4B蛋白在BVDV感染宿主细胞及其免疫逃逸机制奠定了基础。

2011—2017年单中心儿童非病毒性肝病谱分析

目的探讨单个儿童肝病中心非病毒性肝病的疾病谱及变化趋势。方法收集2011年1月—2017年12月在我院青少年肝病诊疗中心住院诊治的0~16岁儿童非病毒性肝病患者数据,统计并分析其在同期收治的儿童肝病患者中的占比、疾病谱及病种分布。并与1983年6月—2000年12月、2001年1月—2010年12月同类病例数据作比较。结果2011年1月—2017年12月儿童非病毒性肝病患者占同期儿童肝病患者总数的23.30%(925/3967),较2001年1月—2010年12月的17.53%(703/4010)有所上升。2011年1月—2017年12月儿童非病毒性肝病疾病共72种,病例中以药物性肝损害(31.0%)最多,其次为肝豆状核变性(13.7%)和非酒精性脂肪性肝炎(11.0%);而2001年1月—2010年12月构成比前三名的疾病为肝豆状核变性(22.62%)、药物性肝损害(10.53%)和糖原累积病(9.53%)。不同年龄段居于前三位的病种分别为,1岁以下:药物性肝损害(31.3%),糖原累积病(13.4%),胆汁淤积型肝病(11.9%)。1~6岁:药物性肝损害(28.8%),肝豆状核变性(16.8%),糖原累积病(12.2%)。7~16岁:药物性肝损害(32.9%),非酒精性脂肪性肝炎(19.8%),肝豆状核变性(12.5%)。儿童非病毒性肝病重叠病毒性肝炎的发生率为11.6%(107/925),值得关注。7.8%(72/925)的儿童非病毒性肝病疑难病例通过基因检测等特殊检查得到确诊,但仍有2.9%(27/925)目前无法确诊。结论近30年来儿童非病毒性肝病占比逐渐增多,药物性肝损害和非酒精性脂肪性肝病增长迅速。质谱基因检测技术的应用进一步扩展了疾病谱。