猪非典型瘟病毒广西流行株的鉴定与遗传进化分析

为了解猪非典型瘟病毒(APPV)广西流行株的遗传进化特点,本研究从广西3个地区共采集23份患先天性震颤(CT)症状的新生仔猪脑、肝脏、脾脏、肾脏等组织样品,采用荧光定量RT-PCR (RT-q PCR)检测APPV,经RT-PCR分段扩增APPV阳性样品的全基因组序列,结果显示,检出18份APPV阳性样品,RT-PCR分段扩增并经测序拼接后共获得4条APPV广西流行株全基因组序列,结合Gen Bank登录的共有9条APPV广西流行株全基因组序列,采用BLAST及Bio Edit软件分析APPV广西流行株全基因组序列的相似性;利用Mega 7.0软件绘制ORF、N^(pro)、E^(rns)及E2基因的系统发育树;通过Bepipred 2.0软件预测APPV囊膜糖蛋白E^(rns)、E2蛋白的线性抗原表位;利用Net NGlyc 1.0在线软件预测APPV E^(rns)、E2蛋白N-糖基化位点;利用RDP5和Sim Plot软件分析APPV广西流行株全基因组的重组性。相似性结果显示,9条APPV广西流行株全基因组序列与Gen Bank中APPV流行株全基因组序列的相似性最高为89.9%~99.8%,且这些流行株分别来源于河北、湖北、湖南、四川、广西及广东等地;APPV广西流行株之间及与国内外APPV参考株全基因组序列的相似性分别为79.4%~99.6%及77.1%~98.3%,表明APPV广西流行株基因组进化来源广泛且复杂,并且APPV广西流行株之间的差异较大。遗传进化分析显示,ORF系统发育树分为3个基因型,APPV广西流行株GX01-2019属于I-2基因亚型,GX02-2018株属于I-3基因亚型,GX02-2019株属于Ⅱ基因型,其余则属于I-1基因亚型,N^(pro)、E^(rns)、E2基因的系统发育趋势与ORF基本一致。表明APPV广西流行株以I基因型为主,且无时间地域分布特点,并具有生物遗传多样性特征;抗原表位和N-糖基化位点预测结果显示,E^(rns)蛋白主要含aa7~aa14、aa24~aa36、aa39~aa66等7个抗原表位,E2蛋白主要含aa5~aa9、aa16~aa25、aa35~aa111等5个抗原表位;APPV广西流行株E^(rns)蛋白N-糖基化位点分别为^(12)NSTG^(15)、^(43)NETI^(46)及^(64)NYTC^(67),E2蛋白N-糖基化位点分别为51NG(D或E)S(T)L54和64NTSS(I)67;重组分析结果显示,广西流行株APPV_China/GX-WZ/2017有重组信号,主要亲本为广西GX01-2018株,二者相似性为99.7%,次要亲本为韩国的KU16-2株,二者相似性为100%。本研究为广西地区APPV分子流行病学研究和遗传进化分析提供了基础数据。

湖南一株猪非典型瘟病毒的鉴定及其NS5B和E2基因序列分析

随机挑选湖南某规模化猪场出现“抖抖病”的新生仔猪,采集血清样本,用可扩增猪非典型瘟病毒(APPV)的NS5B基因和E2基因引物进行RT-PCR鉴定,对PCR扩增产物测序。随后利用MegAlign软件分析NS5B和E2基因序列的同源性,预测E2蛋白部分结构,并使用MEGA 5.0,采用邻接法构建NS5B和E2基因的遗传进化树。结果表明,发病仔猪为猪非典型瘟病毒(APPV)感染阳性。鉴定毒株HN0626与GenBank中84株参考毒株NS5B和E2基因序列的同源性分别为81.68%~98.95%、81.14%~99.33%,通过预测E2蛋白部分结构,推导其潜在的B细胞抗原表位。系统发育分析显示,HN0626毒株属于基因1型,是全球猪群中的主要流行毒株,其E2、NS5B基因序列在GenBank中的登录号分别为OR936135、OR936136。

猪静脉血管内皮细胞cDNA文库构建及与猪非典型瘟病毒云南株关键变异基因互作蛋白的筛选

近几年,猪非典型瘟病毒(APPV)在世界多个养猪国家相继报道,临床症状呈不典型性,给养猪业造成了较大的经济损失。为了解猪非典型瘟病毒云南株关键变异基因(APPV-YN Mut)与宿主可能存在相互作用的蛋白,深入研究APPV-YN Mut基因的功能及其非典型化机制,利用酵母双杂交技术,构建了猪静脉血管内皮细胞(SVEC)cDNA文库,并进一步采用建立的SVEC cDNA文库与诱饵质粒pGBKT7-Mut共转Y2H Gold酵母菌,筛选与Mut蛋白相互作用的蛋白,对筛选出的蛋白进行测序和生物信息学分析。结果表明,构建的诱饵载体在酵母细胞中成功表达,且无毒无自激活;构建的SVEC cDNA文库容量大于1×106 CFU/mL,文库滴度6.2×106 CFU/mL,PCR显示文库插入片段大小在250~3000 bp,条带大小不一,符合文库大小要求;与SVEC cDNA文库筛选发现14种与Mut蛋白存在潜在互作的宿主蛋白,通过蛋白功能分析发现这些蛋白主要与病毒复制、细胞凋亡、钙离子结合、蛋白代谢和降解有关。研究结果有助于进一步探索14种潜在互作蛋白中到底哪些与Mut发生密切互作,且与病毒感染宿主密切相关,为研究APPV-YN Mut基因功能及其致非典型化作用机制奠定了理论基础。

猪非典型瘟病毒云南株Mut蛋白的特征分析及其对宿主细胞NF-κB转录活化的影响

猪非典型瘟病毒(APPV)是近年来新发现的猪病毒性病原,给养猪业健康发展带来了严重的威胁。课题组前期研究发现了APPV云南株(APPV-YN)导致感染猪临床症状非典型化的关键基因Mut,为探讨APPV-YN Mut的生物学特征及其对宿主细胞NF-κB信号通路转录活化的影响,揭示APPV非典型化的机制。利用SnapGene、ProtParam、PredictProtein、TMHMM、SignaIP 4、ProtScale等在线软件对APPV-YN Mut基因表达蛋白的理化性质、亚细胞定位、磷酸化位点等进行分析预测;将重组载体pCMV-Mut转染至HEK-293细胞,确定蛋白稳定表达后利用TNF-α刺激NF-κB信号通路使其活化,分析APPV-YN Mut对NF-κB转录活性及其对NF-κB P65核质转运的影响。生物信息学分析结果显示,Mut蛋白为亲水性的稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽,可能主要定位于细胞质,二级结构主要以无规则卷曲为主,三级结构稳定,可能作用于PKC、P38MAPK、PKA、EGFR、CDK5等相关激酶及蛋白受体;Mut蛋白在HEK-293细胞成功表达,大小约为15 ku;Mut对TNF-α激活的NF-кB转录活化有明显抑制作用,干扰NF-κB P65的入核,抑制核质穿梭过程。研究结果为后续进一步在分子水平上探究Mut在APPV非典型化中的作用奠定了基础。

猪非典型性瘟病毒研究进展

猪非典型性瘟病毒(Atypical porcine pestivirus,APPV)是一种近年来新发现的瘟病毒属病毒,对全球养猪业造成了重大损失。APPV被认为是引起仔猪先天性A-Ⅱ型震颤的病原,可导致仔猪全身肌肉震颤,影响进食,进而因饥饿而死亡。APPV于2015年在美国首次被发现,主要集中分布在美洲、西欧、东亚地区,现已在中国多个省市被发现。目前已开发出多种诸如PCR和血清学技术检测APPV感染的方法。虽然APPV的研究取得了一定进展,但对其起源、流行病学和传播动态等方面的理解仍非常有限。由于APPV分离培养困难以及缺乏合适的替代试验动物模型,限制了其商业化疫苗的研发,为疫病防控带来难度。作者着重综述了目前国内外关于APPV的进化与分型、基因组结构、病原分离培养、组织嗜性与传播途径、病原检测技术和疫苗研发等方面最新进展,旨在充分了解其蛋白功能和分子机制,以期为研究人员开发有效的诊断工具、制定成功的控制策略提供理论依据。

猪繁殖与呼吸综合征病毒与非典型瘟病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立同时快速简便地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与非典型瘟病毒(APPV)两种病毒的方法,本研究根据GenBank中登录的PRRSV、APPV的基因序列,选取PRRSV的ORF2基因和APPV的NS2基因分别设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测PRRSV与APPV的双重RT-PCR方法。利用该方法对PRRSV、APPV重组质粒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒的cDNA和阴性对照进行检测,结果显示除PRRSV和APPV重组质粒扩增结果为阳性外,其余均为阴性,表明其特异性良好;该方法对APPV和PRRSV质粒标准品的最低检出量分别为2.17×10~4拷贝/μL、3.13×10~3拷贝/μL,敏感性较高;同时批间和批内重复性试验表明该方法重复性好。利用该方法对四川地区临床73份疑似仔猪颤抖病与猪繁殖与呼吸综合征病的病料样品进行检测,结果与单一RT-PCR的检测符合率为100%。本研究建立的双重RT-PCR方法具有良好的实用性,可用于临床样品的检测,对临床早期诊断具有重要意义。

猪非典型性瘟病毒与猪流行性腹泻病毒双重PCR方法的建立与应用

为了快速准确地检测出猪非典型性瘟病毒(APPV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV),根据Gen Bank中发布的PEDV S2基因和APPV NS3基因的序列,分别选取PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列,设计、合成了1对特异性引物。通过对体系进行优化,分别扩增出190 bp和500 bp的特异性片段。建立的双重RT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪轮状病毒(RV)的检测均为阴性。对PEDV和APPV的最低检出量分别为1μl 2.65×10~5和1μl 3.56×10~4,对四川遂宁、眉山等地采集到的腹泻、肌肉震颤的病料进行检测,PEDV、APPV阳性病料检出率分别为41. 18%和11. 76%,经分别与特异性检测APPV和PEDV的单一RT-PCR法检测结果进行比较分析,符合率均为100%。与单一RT-PCR检测方法具有相同特异性和重复性,可用于临床检测。

非典型性瘟病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,本实验建立了APPV SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法特异性试验结果显示,除APPV外,猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒等常见猪病病原检测均为阴性,表明其特异性良好;该方法最低检测限为2.8×10~3拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验的组内、组间变异系数均小于1%。利用该方法对临床56份来自四川各地的临床病料样品进行检测,检出5份阳性样品,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。本研究建立的APPV荧光定量RT-PCR检测方法为APPV临床检出以及后期并发症的研究奠定了基础。

我国非洲猪瘟防控进展

非洲猪瘟(以下简称“非瘟”,ASF)是当前我国最重要的猪病。历经波折,尽管还有“假疫苗”、病死猪处置不当等问题,我国非瘟防控逐步走向正轨。本文从我国非瘟流行阶段划分、非瘟临床流行毒株的特点、实验室检测、主要的传播方式、非瘟病毒(ASFV)感染场线的临床分类、不同毒力毒株的早发现技术和临床处置决策、非瘟疫苗研究进展、非瘟的净化进展、非瘟防控方向这九个方面,从不同维度展示我国非瘟防控进展。

基于E^rns蛋白的猪非典型瘟病毒间接ELISA检测方法的建立

猪非典型瘟病毒(APPV)是新近发现的仔猪先天震颤的病原体,其血清学检测方法亟待建立.E^rns蛋白是APPV诱导机体产生中和抗体的重要保守性抗原,是血清学检测的特异性靶标之一.本研究制备了猪非典型瘟病毒原核表达的Erns蛋白,以其作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法.结果表明,最佳抗原包被浓度为8μg/mL,最佳血清稀释度为1:10,阴阳性临界值D450=0.318,灵敏度达到1:64,特异性好,与猪瘟、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流感及圆环病毒病的阳性血清均不发生交叉反应.该检测方法重复性好,批内变异系数最大值为7.84%,批间变异系数最大值为8.57%.利用建立的间接ELISA方法对50份猪临床血清样本进行了检测,其阳性率为10%.基于Erns蛋白间接ELISA检测方法的建立为APPV的流行病学调查和临床诊断提供了有效的工具.

猪非典型性瘟病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、准确检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,根据GenBank发布的APPV NS2基因序列,设计合成1对扩增后目的基因片段大小为500 bp的特异性引物。建立的RT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性,该方法对APPV的最低检出量为1μl 4.95×10~4拷贝,重复性试验中组间、组内试验结果均与预期相符。应用该方法对68份疑似患病的仔猪样品进行检测,阳性病料检出率为7.35%。利用Mega7.0绘制APPV系统进化树,对APPV进行遗传进化分析,结果显示本试验检出的APPV(SC株)与中国报道的APPV的亲缘关系较近。建立的APPV RT-PCR检测方法可用于APPV的临床诊断及流行病学检测。

猪非典型瘟病毒(APPV)研究进展

猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus,APPV)是2015年新发现的瘟病毒属病毒,国际病毒分类学委员会2017年将其确定为瘟病毒属K(Pestivirus K)的代表毒株。该病毒可导致仔猪先天性震颤(congenital tremor,CT),典型症状为仔猪轻微震颤,头部和四肢明显。目前APPV已在全球广泛流行,我国也有相关报道,关于该病毒研究的报道越来越多,但研究进展的报道相对较少,目前已证实其与CT紧密相关。APPV不容易被分离,缺少最重要的病毒攻毒试验结果,疫苗研究也需要在前期基础研究深入的基础上才有可能获得成功。为此,本文从病原学、流行病学、诊断技术及疫苗研发等方面,对取得的最新研究进展进行概述,以期增强人们对APPV的认识,为我国防控与研究APPV提供参考。

2015—2017年我国部分地区猪非典型瘟病毒的遗传变异分析

猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus,APPV)是一种能引起仔猪先天性震颤的病原。为了解我国APPV感染状况、基因组以及遗传变异特征,采用套式RT-PCR方法,对2015—2017年我国22个省(自治区、直辖市)93个猪场的285份血清样本进行了APPV核酸检测和E 2基因序列分析;并对发病猪组织样本进行了APPV全基因组扩增与序列测定和遗传变异分析。结果显示,检测样本的APPV阳性率为25.26%(72/285,95%CI=20.3%~30.7%),且阳性率逐年升高;猪场APPV阳性率为38.71%(36/93,95%CI=59.7%~94.8%)。扩增出的35条APPV E 2基因的核苷酸序列相似性为83.4%~100.0%,推导氨基酸序列相似性为90.5%~100.0%。基于E 2基因的遗传变异分析显示,APPV临床毒株可被分为4个亚群,大多数国内APPV临床毒株可归入亚群1,与美国的000515株遗传关系较近;少数临床毒株与Bavaria S5/9、NL1 Farm1等欧美毒株同属于亚群2;6条测定序列被划分至亚群3;亚群4的成员均来自广东;其中亚群3与亚群4均由国内APPV临床毒株构成。全基因组序列遗传变异分析表明,全球APPV毒株可归为2大分支,本研究中测序的毒株CHheb1701与所有国外毒株属于同一分支,且与GX04/2017遗传关系最近,与美国毒株000515同聚为一簇;而第二分支中的毒株均来自我国广东省。以上研究表明,我国猪群中APPV感染已较为普遍,毒株多样且变异广泛,同时,也提示毒株可能有不同的来源,为进一步开展APPV的防控及相关研究奠定了重要基础。

猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

一起猪非典型瘟病毒感染的诊断

2017年8月四川省某规模化猪场出现临产母猪产弱子、发抖、死胎,且死胎率达30%,哺乳仔猪成活率明显降低,其中以全身性或局部性阵发痉挛为典型症状。用RT-PCR扩增及序列分析确诊该猪场感染了一种新型的猪非典型瘟病毒(APPV)。这是四川省首次检测到并报道APPV,可为该病的研究和防控提供了一定的参考。

猪非典型性瘟病毒(APPV)研究进展

猪非典型性瘟病毒(APPV)是近两年来新发现的猪病毒性病原,引起新生仔猪先天性震颤,可导致仔猪站立困难、吮乳受阻甚至死亡,严重威胁着养猪业的持续健康发展.本文从APPV的发现与流行现状、病原特征、临床表现和病理变化及检测技术等方面的研究进展进行了综述,以期为APPV的防控工作提供参考.

两广地区3株猪非典型瘟病毒的流行及遗传演化分析

为了解我国两广地区猪非典型瘟病毒(APPV)的流行及变异情况,本研究于2017年~2018年从该地区的两个规模化养殖场采集了10份患先天性震颤仔猪的各组织病料样品,利用RT-PCR进行APPV检测,挑选3份阳性样品进行该病毒的开放阅读框(ORF)基因序列的RT-PCR扩增、测序,并对ORF基因、该基因包含的E2和P7基因进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析及该3种基因的遗传进化分析。结果显示,10份病料样品均为APPV阳性,采用RT-PCR分段扩增获得3株APPV的ORF基因全长序列。ORF基因序列分析显示,3株APPV之间的核苷酸同源性为81.6%~99.8%,与41株中国株的同源性为80.8%~99.3%,与19株国外参考株的同源性为81.3%~91.1%;E2和P7基因的同源性分析结果与ORF基因同源性分析结果一致。ORF、E2和P7基因的遗传进化树显示,广西猪场分离的GX-GL1株和GX-GL67株属于基因1型,而广东猪场分离的GD-CT4株属于基因3型。上述结果表明3株APPV与中国株的亲缘关系更近,两广地区的APPV基因型呈现地域差异性,本研究有助于了解APPV在中国的流行情况。

多重TaqMan荧光定量PCR检测仔猪先天性震颤相关病毒方法的建立与应用

旨在研究能够快速、准确、灵敏地鉴别、诊断引起仔猪先天性震颤的猪非典型瘟病毒(Atypical porcine pestivirus,APPV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒3型(Porcine circoviruses type 3,PCV-3)及猪捷申病毒1型(Porcine teschovirus 1,PTV-1)的方法。通过对GenBank中登录的APPV的NS3基因序列、CSFV的E2基因序列、PCV-3的ORF2基因序列和PTV-1的VP1基因序列进行分析,设计针对4种病毒的特异性引物和TaqMan水解探针。通过对反应条件和反应程序进行优化,拟建立针对仔猪先天性震颤相关病毒的多重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,研究得到的多重TaqMan荧光定量PCR检测方法能够特异性检测APPV、CSFV、PCV-3和PTV-1,而与其他病原无交叉反应;该研究方法对APPV、CSFV、PCV-3和PTV-1的最低检测量分别为1μl 9.2×10^2拷贝、48拷贝、56拷贝和17拷贝。重复性试验结果显示,组内、组间变异系数均小于2.10%,重复性和稳定性较为突出。用该方法对273份临床样品进行检测,结果显示,APPV、CSFV、PTV-1和PCV-3的阳性率分别为20.5%、2.9%、1.5%和10.6%,其中APPV、CSFV二者共同感染的检出率为1.5%,APPV、PCV-3二者共同感染的检出率为4.4%,APPV、PTV-1二者共同感染的检出率为1.5%,APPV、CSFV、PCV-3共同感染的检出率为1.1%。该检测方法操作简单、耗时短、不易对环境造成污染,检测结果灵敏、准确,基于该方法对四川地区仔猪先天性震颤相关病毒共感染情况进行的流行病学调查,可以为后期研究提供重要的数据基础。

猪非典型瘟病毒的基因组特征分析及荧光定量RT-PCR检测方法的建立

最近的研究表明,猪非典型瘟病毒(APPV)在我国猪群流行,并造成了严重的危害。本研究应用RT-PCR方法对APPV GD3株进行了全基因组扩增、测序,并进行了全基因组及其部分编码基因的遗传演化分析;根据APPV基因组编码的结构蛋白E2的基因序列,构建了APPV的荧光定量RT-PCR检测方法。APPV GD3株的全基因组序列与德国、美国、荷兰和西班牙毒株在不同的进化分支上,同源性为83.1%~83.4%;与中国毒株GD1、GD2和GD的同源性分别为99.5%、99.6%和83.4%。GD3株编码的E2、Npro和Erns基因与国内外现有毒株的同源性分别为83.1%~99.7%、80.2%~99.8%和81.9%~99.5%。本研究建立的荧光定量RTPCR检测方法特异性强、最低检测浓度为10 copes/L、操作简单、耗时短,具有良好的兽医临床应用前景。

猪非典型瘟病毒和盖塔病毒双重RT-PCR方法的建立与应用

为快速准确地检测出猪非典型瘟病毒(APPV)与盖塔病毒(GETV),根据GenBank中公布的APPV NS3基因和GETV NSP3基因序列,选择APPV NS3基因和GETV NSP3基因的保守序列,各设计并合成了1对特异性引物。通过优化反应体系和反应条件,最终建立可以同时扩增出500和810 bp特异性片段的双重RT-PCR。该方法对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪流行性腹泻病毒的扩增结果均为阴性。对APPV和GETV重组质粒的最低检出量分别为187和126 copies/μL并具有高重复性。应用本方法检测从四川自贡市、泸州市等地采集的38份仔猪肌肉震颤样本,结果显示,APPV、GETV的阳性率分别为13.16%和7.89%,与单一RT-PCR方法对APPV和GETV的检出率完全一致。本研究中成功建立的APPV、GETV双重RT-PCR方法为APPV和GETV的快速检测提供了技术手段,有助于仔猪先天性震颤的临床诊断和流行病学调查,对于公共卫生也有一定意义。