平滑肌细胞迁移的肌球蛋白轻链非磷酸化途径

为了阐明平滑肌细胞迁移存在肌球蛋白轻链非磷酸化调节途径,研究花生四烯酸(arachidonicacid,AA)对肌球蛋白轻链非磷酸化状态下平滑肌细胞迁移的影响及其相关的信号传导途径.经Boyden小室跨膜迁移实验发现,AA对培养的兔血管平滑肌SM3细胞具有明显的诱导迁移作用.然而,当预先用10μmolL肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinase,MLCK)特异性抑制剂ML7作用SM3细胞后,发现AA对SM3细胞仍然具有明显的诱导迁移作用,并呈剂量依赖性,这种诱导作用可被细胞外信号调节激酶12(ERK12)的特异性抑制剂PD98059或磷脂酶C(PLC)的特异性抑制剂U73122所拮抗.此外,Ⅱ型肌球蛋白抑制剂blebbistatin(BLB)可部分抑制“非磷酸化”状态下AA的诱导迁移作用.经Western印迹检测显示,10μmolLML7可完全抑制SM3细胞中20kD肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化,并且加入AA后MLC20仍为非磷酸化状态.应用免疫荧光染色法观察肌动蛋白在SM3细胞中分布的变化,发现在AA作用下肌动蛋白呈细胞边缘聚集现象,有伪足形成,细胞形态表现为迁移状态.预先用ML7作用后再加入AA,肌动蛋白的分布与上述结果相同.研究结果初步表明,在平滑肌细胞迁移的作用途径中,在MLC磷酸化调节途径受到抑制时,AA可诱导MLC非磷酸化的平滑肌细胞发生迁移,其分子机理可能与ERK12和PLC信号传导途径有关,非磷酸化的肌球蛋白直接参与了该迁移过程.

合成海藻糖的新型非磷酸化酶

九十年代中期以后非磷酸化合成海藻糖的新酶系列及相关微生物 (多为极端微生物 )被发现 ,不同菌株纯化得到的新酶虽在专一性及酶特性方面存在差异 ,但均为非磷酸化酶。基因测序及同源性分析表明这些新酶与淀粉酶家族具有很强的同源性。一些文献报道了这些新酶合成海藻糖的作用机制 ,基本证实酶Ⅰ (MTSase、GTase和TSase)的分子内转糖基作用及酶Ⅱ (MTHase和Amylase)对麦芽寡糖基海藻糖的专一性内切作用 ,但这些新酶的作用机制仍需深入研究。

血清非磷酸化MGP蛋白(dpMGP)对强直性脊柱炎的诊断意义

目的研究强直性脊柱炎(AS)患者血清dpMGP浓度水平及其诊断价值,探索dpMGP与AS炎症与骨化病程的关系。方法将82例AS病人及75例健康对照纳入该横断性研究。评估AS病人各项临床指标(年龄、性别、病程、疾病活动度)以及反映骨代谢或炎症的生物标记(血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、骨钙素(OC)、骨碱性磷酸酶(BALP))。疾病活动度依据BASDAI评分标准。利用竞争性ELISA法检测AS病人dpMGP血清浓度。将上述指标与对照组进行比较性分析。利用ROC曲线回归分析dpMGP作为AS诊断指标的价值。通过运用统计学相关分析的方法,研究dpMGP及AS炎症与骨重建病程关联。结果 AS患者dpMGP浓度(mean(SD),9.2(2)nmol/l)低于对照组(mean(SD),13.7(4.5)),P<0.01。同样结果见于20-40岁(mean(SD),9.6(2)nmol/l)及40-60岁(mean(SD),9(2.1)nmol/l)年龄组。两年龄组dpMGP浓度比较差异并不明显。ROC曲线回归分析显示dpMGP=11.5nmol/l(截断点)时诊断特异性及敏感性分别为83%、88%,youden指数为0.56,AUC为0.81,其诊断效力可为中级。炎症相关生物标记ESR、CRP,以及骨重建相关生物标志BALP、OC与dpMGP关联性并不明显。结论 AS病人血清dpMGP可作为一种新的血清诊断指标及反映骨化进展的生物标志。

非磷酸化肌球蛋白在血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞迁移中的作用

为了阐明非磷酸化肌球蛋白在平滑肌细胞迁移中的作用,研究探讨了非磷酸化肌球蛋白是否介导了血小板衍生生长因子(PDGF)诱导豚鼠脑基底动脉平滑肌细胞(GbaSM-4)的迁移。研究结果显示,20ng/ml以下剂量的PDGF可诱导GbaSM-4细胞发生迁移,此时肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化水平无变化。该迁移作用可被肌球蛋白特异性抑制剂blebbistatin所拮抗。应用RNA干扰技术抑制肌球蛋白轻链激酶表达,经免疫印迹检测经果显示,MLC20的磷酸化水平发生了显著下降;但对PDGF诱导的迁移作用无影响;在RNA干扰后blebbistatin也可抑制其迁移作用。体外ATP酶活性测定结果显示,blebbistatin对从平滑肌中提取的非磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性有明显的抑制作用,其主要作用位点位于肌球蛋白头的头部S1。上述结果提示,非磷酸化的肌球蛋白参与了PDGF诱导的平滑肌细胞迁移。

宫颈阴道分泌物非磷酸化胰岛素样生长因子结合蛋白-1与残余羊水指数监测在疑似未足月胎膜早破中的价值

临产前的胎膜破裂称为胎膜早破（PROM）,孕龄〈37孕周的PROM称为未足月胎膜早破（PPROM）,可并发宫腔感染,导致早产、围生儿死亡等不良结局,是母儿患病和死亡的重要原因之一[1]。预见PPROM的危害,重视其高危因素,积极采取临床干预措施可有效降低其引发的并发症[2]。

强直性脊柱炎患者血清非磷酸化基质γ-羧基谷氨酸蛋白和巨噬细胞集落刺激因子水平与骨代谢生物化学指标的相关性

目的研究强直性脊柱炎患者血清非磷酸化基质γ-羧基谷氨酸蛋白(dp MGP)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)水平与骨代谢生物化学指标的相关性。方法选择信阳市中心医院2014年4月至2016年8月收治的强直性脊柱炎患者82例为观察组,另选取体检健康者54例作为对照组。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验测定2组患者血清中M-CSF、骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(OC)水平,采用竞争性酶联免疫吸附试验检测血清dp MGP水平,分析dp MGP、M-CSF与BALP、OC的相关性。结果观察组患者血清中dp MGP、M-CSF水平高于对照组(P<0.05);2组研究对象血清中BALP、OC水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。2组研究对象血清dp MGP水平与BALP、OC无相关性(r=-0.326、0.427,P=0.084、0.125);血清M-CSF水平与BALP、OC呈负相关(r=-0.357、-0.538,P=0.043、0.047)。结论强直性脊柱炎患者血清M-CSF水平与BALP、OC呈负相关,可通过检测M-CSF水平来判断骨代谢情况。

血清非磷酸化-未羧化的基质gla蛋白水平与2型糖尿病患者膝下动脉钙化的相关性研究

目的探讨T2DM患者血清非磷酸化-未羧化的基质gla蛋白(dp-ucMGP)水平与膝下动脉钙化的关系。方法收集2014年5月至2015年5月于我院内分泌科或血管外科住院的146例T2DM患者,ELISA检测血清dp-ucMGP水平。所有研究对象均行下肢动脉64排螺旋CT血管成像(CTA)并计算膝下动脉钙化积分,检测患者HbA_1c、血钙、血磷、甲状旁腺激素(PTH),25羟维生素D[25(OH)D]水平。结果根据膝下动脉钙化积分分为:正常组(NC,n=20)、轻中度钙化组(n=70)和重度钙化组(n=56),各组血清dp-ucMGP水平分别为330(265.5,394.5)、480(407,553)、720(640,800)pmol/L(P<0.01);与NC组比较,轻中度钙化组和重度钙化组男性、年龄、心血管疾病病史、BMI、WHR、血清PTH水平差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。多因素回归分析发现,血清dp-ucMGP水平是膝下动脉钙化的独立预测因素,独立于年龄、性别、心血管疾病病史。结论血清高水平dp-ucMGP与T2DM患者膝下动脉钙化积分独立相关。

血清非磷酸化未羧化基质Gla蛋白与绝经后骨质疏松症的关系

目的探讨血清非磷酸化未羧化基质Gla蛋白(dp-ucMGP)与绝经后骨质疏松症(PMOP)及骨代谢指标的关系。方法选取2017年12月至2019年12月在赣南医学院第一附属医院健康体检中心就诊或内分泌代谢科住院的绝经后女性共248名作为研究对象。采用双能X线吸收骨密度仪(DXA)测定骨密度(BMD)。根据BMD将研究对象分为骨量正常组(n=86)、骨量减少组(n=64)和PMOP组(n=98)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清dp-ucMGP水平。并检测血钙、血磷、血β胶原降解产物Ⅰ型胶原羧基端肽(β-CTX)和Ⅰ型前胶原N-端前肽(PINP)等骨代谢指标。结果3组间年龄、绝经年限、体重指数(BMI)、骨钙素、β-CTX、PINP和dp-ucMGP差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析表明血清dp-ucMGP与年龄(r=0.254,P=0.042)、绝经年限(r=0.343,P=0.036)、β-CTX(r=0.023,P=0.025)呈正相关,与BMI(r=-0.169,P=0.041)、腰椎BMD(r=-0.176,P=0.031)、股骨颈BMD(r=-0.234,P=0.025)和骨钙素(r=-0.176,P=0.034)呈负相关。二元logistic回归分析提示年龄(OR=1.164,P=0.024)、绝经年限(OR=1.151,P=0.031)、β-CTX(OR=1.122,P=0.037)和dp-ucMGP(OR=1.244,P=0.033)为PMOP的危险因素,校正年龄和绝经年限后,dp-ucMGP(OR=1.237,P=0.045)仍为PMOP的危险因素。结论血清dp-ucMGP可能成为PMOP的潜在生物标志物。

非磷酸化信号转导与转录激活因子在肿瘤形成和信号转导调节中的新作用

信号转导与转录激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）主要参与介导细胞因子和生长因子对细胞的信号转导作用。在过去的研究中我们知道磷酸化的STAT在细胞的增殖、分化、周期调控及凋亡过程中起重要作用，其过度活化导致细胞的异常增殖和凋亡障碍，促进肿瘤的发生发展。近几年来，有关研究发现非磷酸化的STAT很有可能作为一种转录激活因子在肿瘤形成和信号转导调节中起重要的作用。本文就其研究作一综述。

宫颈阴道分泌物非磷酸化胰岛素样生长因子结合蛋白1与残余羊水指数监测在未足月胎膜早破中的诊断价值

目的：通过对疑似未足月胎膜早破（PPROM）孕妇进行宫颈阴道分泌物非磷酸化胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP-1）与残余羊水指数（AFI）监测，探讨快速诊断 PPROM的方法，以及残余羊水对母儿预后的影响。方法采用快速层析法对96例疑似 PPROM孕妇进行宫颈阴道分泌物 IGFBP-1检测，腹部 B超监测 AFI，分析病因，比较妊娠结局及新生儿预后情况。结果92例宫颈阴道分泌物 IGFBP-1阳性者均确诊为 PPROM，导致 PPROM的危险因素主要为：生殖道感染，流产、引产史，原因不明（包括无证据的感染、胎膜发育不良或其他不明确因素），双胎、多胎、巨大儿，臀位或头盆不称，妊娠期高血压疾病，子宫肌瘤或畸形，营养不良及羊水过多。92例 PPROM孕妇，破膜至分娩时间为（105．7±13．9）h，剖宫产率为51．1％，孕妇发热率为7．6％，胎盘早剥率为4．3％，胎儿宫内窘迫发生率为14．1％，围产期感染率为21．7％，新生儿窒息率为7．6％，新生儿死亡率为7．6％。AFI≤40 mm 组与 AFI ＞40 mm 组比较，破膜至分娩时间显著缩短（t ＝10.904，P ＜0．05），新生儿死亡率显著升高（χ^2＝4．359，P ＜0．05）。结论宫颈阴道分泌物 IGFBP-1与 AFI监测，可快速诊断 PPROM，也可评估妊娠结果及新生儿预后。

平滑肌肌球蛋白轻链激酶对肌球蛋白非Ca^(2+)依赖性磷酸化(2)

为了初步揭示肌球蛋白轻链激酶(MLCK)对肌球蛋白(myosin)非Ca2+依赖性磷酸化的特征 试验方法采用10%甘油聚丙烯酰胺凝胶电泳检测myosin的磷酸化,用孔雀绿法测定myosin Mg2+-ATP酶活性及选择Scoin Image扫描软件分析所获得的数据。提出在MLCK参与的myosin活性调节中,myosin以非磷酸化、非Ca2+依赖性(CIPM)及Ca2+依赖性磷酸化(CDPM) 种状态存在 研究发现非Ca2+依赖性磷酸化myosin有以下特征:(1)耗能(Mg2+-ATP酶活性)高于非磷酸化myosin但低于Ca2+依赖性磷酸化myosin;(2)花生四烯酸(AA)可选择性加强myosin非Ca2+依赖性磷酸化;(3)在本试验条件下,未观察到MLCK抑制剂ML-9对非Ca2+依赖性myosin磷酸化的抑制作用;(4)组胺(histamine)对非Ca2+依赖性的抑制小于对Ca2+依赖性磷酸化的抑制,且这些差异在统计学上有显著性。以上结果提示myosin非Ca2+依赖性磷酸化不仅在程度上。

花生四烯酸诱导肌球蛋白磷酸化被抑制的平滑肌细胞迁移的信号传导途径

在应用肌球蛋白轻链激酶特异抑制剂ML-7抑制了肌球蛋白轻链磷酸化后,花生四烯酸(arachidonicacid,AA)仍可诱导兔血管平滑肌细胞(SM3)发生迁移.为了进一步阐明其信号传导途径,应用多种信号抑制剂,采用免疫印迹、Boyden小室和提取细胞膜蛋白等实验方法,对上述迁移作用的信号传导途径进行了深入的研究.结果显示,PTX(Gi蛋白抑制剂)、U73122(PLC抑制剂)、staurosporine(PKC抑制剂)、PD98059(ERK1/2抑制剂)和SB203580(p38抑制剂)分别可拮抗上述AA诱导的SM3细胞迁移作用,而SP600125(JNK抑制剂)的作用较弱.免疫印迹结果显示,AA可提高SM3细胞中PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK信号的磷酸化水平,呈时间依赖性,PTX或U73122可抑制上述作用;staurosporine可抑制由AA引起的ERK1/2和JNK的磷酸化水平增强,但对p38的磷酸化水平无影响.还发现AA可促进PLCβ2的细胞膜移位,PTX可抑制其作用.上述结果表明,当肌球蛋白轻链的磷酸化被抑制后,AA可通过Gi蛋白的活化促进PLCβ2向细胞膜移位,进而通过激活PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK等信号转导途径而诱导SM3细胞发生迁移.

假激酶在细胞信号转导中的功能

蛋白质激酶是一个庞大的蛋白质家族,参与了真核细胞的绝大部分信号转导。激酶的磷酸化功能已得到较为深入的研究,而一些激酶在进化过程中由于关键模体的关键氨基酸突变/缺失而失去了激酶活性,称之为“假激酶”。假激酶在不同物种间是保守的,这一现象说明它们虽然不具备磷酸化活性,但可能具有其他一些非磷酸化功能。最近的研究证实,假激酶具有这些非磷酸化功能,并以此参与细胞内信号转导,包括:(1)通过直接结合活性激酶调控其磷酸化活性;(2)通过竞争抑制调控活性激酶的磷酸化活性;(3)作为分子开关发挥不依赖激酶的关键非催化功能;(4)作为信号支架辅助信号转导;(5)发挥磷酸化活性之外的催化功能。这些功能已被证明参与发育、免疫和代谢等重要的生理过程。假激酶的突变或表达异常与多种疾病例如肿瘤、神经系统疾病、代谢性疾病和自身免疫性疾病的发生相关。本文就假激酶在细胞信号转导中的功能进行了概述,并对其未来研究方向进行了展望。

血清dp-ucMGP、BGP水平与2型糖尿病肾脏病变的相关性及预测价值

目的探讨去磷酸-未羧化基质GLA蛋白(dp-ucMGP)、骨钙素(BGP)水平与2型糖尿病肾脏病变(DKD)的相关性及预测价值。方法收集2020年9月~2021年11月在我院内分泌科住院的138例2型糖尿病(T2DM)患者,以尿微量白蛋白/肌酐(ACR)水平分组:ACR<3 mg/mmol为单纯糖尿病组(DM,n=56);ACR在3~30 mg/mmol为早期糖尿病肾脏病变组(eDKD,n=38);ACR>30 mg/mmol为临床糖尿病肾病组(cDKD,n=44);检测患者血中dp-ucMGP、BGP及临床生化指标。结果与DM组相比,eDKD组和cDKD组患者的dp-ucMGP升高,BGP降低(均P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示dp-ucMGP与CRE、UREA、ACR水平呈正相关,与eGFR呈负相关(均P<0.05);BGP与ACR呈负相关(P<0.05);Logistic回归提示dp-ucMGP是DKD的危险因素,BGP是DKD的保护性因素。通过ROC曲线分析确定两者联合诊断DKD的敏感性0.781,特异性0.750,AUC是0.838(95%CI:0.773~0.902)。结论dp-ucMGP是DKD的危险因素,BGP是DKD保护因素,两者可能对DKD的诊断具有一定价值。

HPV感染与ERK信号通路关键因子在宫颈癌中的交互效应及临床意义

目的:探讨HPV感染与ERK信号通路关键因子在宫颈癌中的交互效应及意义。方法:选取2020年10月至2022年10月我院收治的宫颈癌患者90例,作为研究组,另纳入宫颈上皮内瘤变患者90例,作为对照组。统计两组HPV感染状况、ERK信号通路关键因子[核不均一核糖核蛋白E1(HnRNP E1)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)、磷酸化非受体酪氨酸激酶(p-Src)]表达,比较研究组不同临床病理特征患者ERK信号通路关键因子表达,Spearman分析两者间相关性,Logi.0stic回归方程分析HPV感染与ERK信号通路关键因子在宫颈癌中的交互效应。结果:研究组HPV感染率及HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白阳性率均高于对照组CINⅠ~Ⅱ、Ⅲ级(P<0.05);宫颈癌患者FIGO分期、HPV感染、分化程度与HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白呈正相关(P<0.05);HnRNP E1、p-ERK1/2、p-Src蛋白及三者交互作用是宫颈癌患者HPV感染高危因素(P<0.05)。结论:HPV感染及ERK信号通路关键因子阳性表达均可增加宫颈癌发病风险,两者存在正向交互作用,可为宫颈癌鉴别诊治提供有利参考信息。

脊髓薄片器官型培养的方法研究(简报)

脊髓的器官培养技术是借助体外培养技术,将脊髓或其一部分分离出来进行培养、研究的技术.因其保留有脊髓神经元及其周围的组织结构,与体内的生理环境相似,是探讨脊髓形态发生、构筑特点、生理功能及病理改变等问题的一条重要途径,在近年来得到飞速发展,成为国际神经科领域的一大研究热点.本文旨在利用脊髓薄片器官型培养技术建立能在体外长期存活的稳定的脊髓培养模型,为进一步的基础和临床研究提供新的实验方法.与此项技术有关的研究国内尚未见报道.

大鼠运动区脑片的培养方法

利用出生后1天的乳鼠大脑活组织切片建立脑片的培养模型,并用抗非磷酸化神经丝单克隆抗体SMI-32对皮层锥体细胞加以鉴定、计数,与生长至同时期的大鼠运动区皮层锥体细胞数目比较,并测定不同时期培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果显示脑片体外生长良好,形态完整,皮层锥体细胞数目恒定,与体内生长的锥体细胞数目无显著差异,培养液中LDH含量稳定。大鼠脑片的培养以及锥体细胞组化鉴定技术为研究有关皮层运动神经元的疾病如肌萎缩侧索硬化提供了有效的方法。

器官型培养的脊髓与体内脊髓的对比

旨在观察体外器官型培养的脊髓薄片是否与同龄大鼠体内生长的脊髓具有相似的形态和恒定的前角a运动神经元数目,建立能模拟体内生长环境的稳定的脊髓器官培养模型。利用出生后8天乳鼠的腰段脊髓组织切片建立脊髓器官型培养模型,用神经元的特异性免疫组化染色SMI-32对脊髓前角a运动神经元加以鉴定并与同龄大鼠体内生长的脊髓做比较。结果发现脊髓体外生长良好,形态完整,a运动神经元数目恒定,与同龄大鼠比较无显著差异,并可长期存活达2个月。脊髓的器官培养技术为研究脊髓生理、病理改变及神经保护提供了有效的方法。

血清dp-ucMGP水平与2型糖尿病肾病终末期肾脏病患者下肢动脉狭窄的相关性研究

目的探讨血清非磷酸化-未羧化的基质gla蛋白(dephospho-uncarboxylated matrix glaprotein,dp-uc MGP)与2型糖尿病肾病终末期肾脏病(end stage renal diseasr,ESRD)患者下肢动脉狭窄的关系。方法选取2015年10月~2016年10月在赣南医学院第一附属医院内分泌科或肾内科住院的2型糖尿病肾病ESRD非透析患者106例,根据双下肢动脉彩超分为三组:轻度狭窄组(n=56)、中度狭窄组(n=32)和重度狭窄组(n=18),测定血清Hb A1c、Ca、P、LDL-C、CRP、PTH、25(OH)D、dp-uc MGP等指标,比较三组上述指标男性、年龄、病程、吸烟、心血管疾病病史和BMI的差异。结果三组血清dp-uc MGP水平分别为514(441,587)pmol/L、685(590,780)pmol/L、763(658,868)pmol/L,各组差异均有统计学意义(P<0.01)。三组患者中男性、年龄、吸烟史、心血管疾病病史、血清CRP、25(OH)D和dp-uc MGP水平差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素回归分析发现血清dp-uc MGP是2型糖尿病肾病ESRD患者下肢动脉狭窄的独立预测因子,独立于年龄、性别、吸烟史、心血管疾病病史。结论血清高水平dp-uc MGP与2型糖尿病肾病ESRD患者下肢动脉狭窄独立相关。

大鼠运动区脑片培养及皮层锥体细胞的组化鉴定

目的:探讨大鼠运动区脑片器官型培养的方法及其皮层第V层锥体细胞的鉴定。方法:利用出生后1天的乳鼠大脑活组织切片建立脑片的器官型培养模型,并用抗非磷酸化神经丝单克隆抗体SM-32对皮层锥体细胞加以鉴定。结果:脑片体外生长良好,形态完整,皮层锥体细胞数目恒定,并可存活1个月以上。结论:大鼠脑片的器官培养技术为研究大脑生理、病理改变及神经保护提供了有效的方法。