非经典细胞焦亡体外模型的构建

旨在深入研究非经典细胞焦亡的激活机制,本研究在体外构建非经典细胞焦亡模型,利用PCR方法扩增人源目的基因Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p30,使用无缝克隆的方法连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC,利用VigoFect试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染的方法构建非经典的细胞焦亡模型,分别检测细胞上清中LDH的释放、GSDMD有无被切割为有活性的N端p30片段和荧光观察PI染色情况来确定非经典细胞焦亡模型是否构建成功。结果显示:pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL重组质粒均成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均成功表达,质粒共转染后LDH分泌显著升高,Caspase-4将GSDMD全长片段切割为有活性N端GSDMD-p30片段,荧光显微镜观察到明显的PI染色,表明非经典细胞焦亡模型体外构建成功。非经典细胞焦亡模型在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。

异氟醚预处理通过抑制caspase-11相关的非经典细胞焦亡途径减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤

目的研究异氟醚预处理通过抑制用随机数字表法肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)过程中细胞焦亡非经典途径而对HIRI产生保护作用。方法建立肝脏缺血再灌注损伤小鼠模型,将30只C57BL/6小鼠分成假手术组(n=10)、异氟醚组(n=10)和手术组(n=10),其中异氟醚组经1.4%异氟醚预处理30 min后行肝脏缺血再灌注手术。用组织HE染色切片观察及病理评分和检测血清中ALT/AST水平的方法评估异氟醚预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。用ELISA法检测血清中IL-1β和IL-18,用Western Blot法检测肝脏组织中GSDMD的蛋白表达,以评价异氟醚预处理对细胞焦亡的抑制作用。用Western Blot法和免疫荧光法检测肝脏组织中caspase-11的蛋白表达,评价异氟醚预处理对细胞焦亡非经典途径的抑制作用。结果HE染色切片的Suzuki's评分结果显示手术组分数较假手术组显著增高(P<0.05),而异氟醚组的分数较手术组显著降低(P<0.05);ALT/AST检测结果显示假手术组血清中ALT/AST显著增高(P<0.05),而异氟醚组的检测结果较手术组显著降低(P<0.05);ELISA结果提示血清中IL-1β与IL-18在手术组中表达明显高于假手术组(P<0.05),异氟醚组中IL-1β与IL-18均明显低于手术组(P<0.05)。Western blot检测肝组织中手术组GSDMD的表达明显高于假手术组,而异氟醚组的表达较手术组明显降低(P<0.05);Western blot和免疫荧光结果均提示I/R组小鼠肝脏组织中caspase-11表达显著高于假手术组(P<0.05),而异氟醚组小鼠肝脏组织中的caspase-11表达较手术组明显降低(P<0.05)。结论异氟醚预处理对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用,而这种作用与其对细胞焦亡非经典途径的抑制相关。

非经典途径细胞焦亡在脓毒血症等炎症性疾病中的作用

细胞焦亡是一种新的程序性细胞死亡方式,分为经典和非经典途径细胞焦亡。近年报道非经典途径与炎症反应密切相关,直接影响脓毒血症、炎症性肠病、呼吸系统疾病、神经系统炎症性疾病等炎症性疾病的发生、发展及转归。当革兰氏阴性菌或脂多糖感染细胞时,可诱导胱天蛋白酶caspase-4/5/11激活,并在细胞内直接结合、切割gasdermin D(GSDM-D)蛋白生成有活性的GSDM-D氨基末端,切割后具有膜打孔活性的GSDM-D氨基末端迁移到细胞膜引起胞膜破裂,胞内容物流出,导致非经典途径细胞焦亡发生;caspase-11被激活后,同时促进经典途径细胞焦亡的发生,活化并释放白细胞介素-1β和白细胞介素-18,加剧炎症反应。Caspase-4/5/11、GSDM-D、Toll样受体4及高速泳动族蛋白B1是非经典细胞焦亡途径的关键分子。深入探讨非经典途径细胞焦亡的发生机制及其在炎症性疾病中作用的最新研究进展,对临床预防、治疗相关疾病具有重要意义。

煤工尘肺患病危险因素及外周血中细胞焦亡的机制研究

目的探索煤工尘肺患病的危险因素,揭示细胞焦亡在煤工尘肺患者外周血中的分子机制,为疾病的治疗提供新的策略和潜在的诊断生物标志物。方法将2020年1月1日至2022年12月31日在新疆维吾尔自治区第三人民医院进行煤工尘肺诊断的疑似职业病劳动者纳入研究,其中煤工尘肺壹期患者77例、贰期患者10例、叁期患者6例,对照组为无尘肺病劳动者(49例)。收集研究对象的一般信息,采集血样测定血常规和血生化结果,测量血浆中白细胞介素(IL)-1β和IL-18水平。结合临床检查结果,进行多因素有序logistic回归分析,评估煤工尘肺的影响因素。同时检测血细胞中细胞焦亡相关蛋白的表达情况,揭示煤工尘肺发病的分子机制。结果142名研究对象均为男性,年龄为(51.65±6.31)岁,工龄为(15.94±9.38)年,各组研究对象的烟龄(F=4.95,P=0.003)和午休分布(H=8.84,P=0.031)差异均有统计学意义。煤工尘肺壹期患者的血红蛋白含量高于煤工尘肺贰期,煤工尘肺叁期的中性粒细胞百分比高于其他3组(P<0.05)。煤工尘肺壹期患者的总胆红素水平和间接胆红素水平高于对照组,而煤工尘肺贰期的红细胞沉降率高于其他3组(P<0.05);煤工尘肺叁期的IL-18和IL-1β水平高于其他3组(P<0.05)。多因素有序logistic回归分析结果显示,烟龄(OR=1.03,95%CI:1.00~1.06)和IL-1β水平(OR=4.61,95%CI:1.59~13.32)是煤工尘肺的独立危险因素(P<0.05)。与对照组比较,煤工尘肺叁期患者核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、消化道皮肤素D蛋白(GSDMD)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4(Caspase-4)等蛋白表达量均明显增高(P<0.05)。结论烟龄是煤工尘肺的危险因素,IL-1β可能是诊断煤工尘肺的潜在生物标志物,且细胞焦亡在煤工尘肺的外周炎症发展中可能发挥作用。