DNA疫苗诱导针对HCV结构区和非结构区蛋白的免疫应答

HCV感染由于病毒高度变异和易慢性化,目前尚无有效的预防和治疗措施。DNA疫苗是近年来免疫学和疫苗学研究领域中的一个热点。由于它能克服传统疫苗的缺陷,制备简单,同时诱发持久的特异性细胞及体液免疫应答,可兼做预防和治疗性疫苗,给病毒性疾病和肿瘤等的防治带来了希望。 作者应用分子克隆技术将HCV(Ib型)

口蹄疫病毒非结构蛋白P3区的基因序列及分析

以口蹄疫Akesu/ 5 8分离株的 5 3代牛舌皮病料为材料 ,采用RT PCR法 ,扩增和克隆了两个约 1.5kb的DNA片段。核酸序列测得结果对接后 ,涵盖了全部P3区的基因序列。口蹄疫Akesu/ 5 8分离株基因组P3区的核酸序列共计 2 ,72 4nt,包括一个终止密码子TAA ,共编码 90 7个氨基酸 ;其中非结构蛋白 3A的基因是 45 9nt,编码 15 3个氨基酸 ;3个 3B(VPg)基因分别是 6 9、72和 72nt,氨基酸分别为 2 3、2 4和 2 4;3C是 6 39nt,2 13个氨基酸 ;3D是1,413nt ,471个氨基酸。各蛋白间由Glu/Gly(Ser)连接。序列比较显示 :3A的C端易变 。

猪水泡病病毒非结构蛋白编码区的克隆与序列分析

以猪水泡病病毒 (Swinevesiculardiseasevirus ,SVDV)HK’70为材料 ,用特异性引物扩增出非结构蛋白编码区的 4个重叠目的片段 ,连接于pMD 18 T载体 ,转化JM 10 9感受态细胞。经对重组质粒双酶切、PCR鉴定、序列分析表明 ,HK’70非结构蛋白编码区核苷酸长 4 0 0 2nt ,氨基酸长 1334aa ;与J1’73、H/ 3’76、SVDV(Seechrn等测株 )、NET/ 1/ 92的核苷酸同源性分别为 98.6 %、98.3%、98.3%、91.2 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 98.9%、99.1%、99.2 %和 97.2 %。

丙肝病毒非结构4区和5区抗原的克隆表达及纯化鉴定

通过分析丙肝病毒（ＨＣＶ） 的非结构４ 区（ＮＳ４） 和５ 区（ＮＳ５）蛋白的氨基酸序列，推测确定抗原决定簇位点。用ＲＴ－ ＰＣＲ 技术从中国丙肝病人血清中扩增克隆含抗原决定簇基因的ＮＳ４ 及ＮＳ５ 基因，将该两段基因分别克隆至质粒表达载体ｐＥＴ２８ａ（ ＋ ） 内，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ，构建成功了高效表达ＮＳ４ 和ＮＳ５ 蛋白的工程菌，ＩＰＴＧ 诱导后两蛋白在工程菌内的表达量分别约占菌体蛋白的３３ ％ 和２８ ％ 。经Ｓｅｐｈａｒｃｒｙｌ Ｓ－ ２００ 分子筛及Ｎｉ－ ＮＴＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ 螯合层析纯化，获得了较纯的重组ＮＳ４ 和ＮＳ５ 蛋白。用纯化的ＮＳ４ 和ＮＳ５ 蛋白作抗原ＥＬＩＳＡ 法检测ＨＣＶ抗体阴、阳性血清，证实它们有较好的抗原性和特异性。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株非结构基因的分子克隆及其基因特征的研究

对猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构基因 (ORF1)和非编码区分别进行了克隆和测序 ,并对其基因特征作了分析。结果表明 ,CH_1a株ORF1全长 11882nt,其中ORF1a长 75 12nt、ORF1b长 4374nt。它们与VR2 332株的核苷酸同源性分别为 89%、92 % ;与LV株的核苷酸同源性分别为 5 4%、6 3.3%。ORF1编码两个聚合蛋白 ,其中ORF1a编码的聚合蛋白经裂解后产生 6个成熟的非结构蛋白 (Nsp1α、Nsp1β、Nsp2_5 ) ,以Nsp2的变异性最为显著 ,它与LV株的氨基酸同源性为 41%。ORF1b编码的聚合蛋白经裂解后 ,产生 4个成熟的非结构蛋白 (RdRpCP2_4) ,其中RdRp为病毒的复制酶 ,CP4表现出较大的变异性 ,与LV株的氨基酸同源性为 48%。在ORF1a_ORF1b的衔接区有保守的庚核苷酸滑动序列和拟节结构 ,它们是核糖体移码翻译所必需的结构。在基因组末端存在非编码区 ,其中 5’NCR长 190nt,比LV株 5’NCR短 31nt,其核苷酸同源性为 6 1%。 3’NCR长 15 1nt,比LV株 3’NCR长 37nt,保守性稍高 ,其与VR2 332株和LV株的核苷酸同源性分别为 95 .4%和 78.2 %。在 3’NCR末端有一个poly(A)尾巴 ,长 2 0nt。在Poly(A)尾上游有保守的八核苷酸序列 ,是复制酶识别并结合的区域。

HCV NS3蛋白单克隆抗体的制备及其识别区域的分析

目的制备针对丙型肝炎病毒(HCV)非结构区NS3全长蛋白的单克隆抗体(MAb),并分析获得的单抗识别表位所在区域,为建立以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究提供抗体工具。方法用原核表达的HCV非结构区NS3全长蛋白作为免疫原,采用小鼠腹股沟皮下NC膜包埋法免疫小鼠,按常规杂交瘤细胞的制备方法,经细胞融合、克隆化制备抗NS3蛋白的MAb。用间接免疫荧光法和Westernblot鉴定其特异性。分别构建NS3丝氨酸蛋白酶(NS3蛋白的N末端13)编码基因的真核表达质粒pcDNA3.1()ns3p、NS3解旋酶(NS3蛋白的C末端23)编码基因的真核表达质粒pcDNA3.1()ns3h,将其瞬时转染COS7细胞后,以获得的单克隆抗体作为一抗,通过免疫荧光分析获得单抗识别表位所在的区域。结果获得了2株抗NS3蛋白的单克隆抗体,这2株MAbs均特异识别NS3蛋白,并确定了它们的结合区域。结论获得了针对NS3蛋白的单克隆抗体,并对其单抗识别表位所在的区域进行了分析,为下一步进行以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究奠定了良好的基础。

丙型肝炎病毒C端截短21个氨基酸NS5B蛋白的克隆、表达及鉴定

构建HCV C端截短21个氨基酸的NS5B(HCV NS5B-C21)的重组原核表达质粒,并获得HCVNS5B-C21蛋白,为以其为靶位的抗HCV药物筛选等创造条件。利用PCR技术扩增HCVNS5B-C21基因,BamHⅠ和XhoⅠ双酶酶切后连接到经同样酶酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得阳性重组质粒pET-28a(+)-NS5B-C21,IPTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白表达产物经SDS-PAGE进行鉴定。成功构建了HCV NS5B蛋白表达载体pET-28a(+)-NS5B-C21,经诱导明显表达出6His-NS5B-C21,截短形式的6His-NS5B-C21表达产物的可溶性明显增加。HCV NS5B-C21蛋白在体外得到了有效表达,表达的蛋白主要存在于上清液中,纯化获得了NS5B-C21蛋白,为抗HCV药物筛选等奠定基础。

抗丙肝病毒NS5蛋白单克隆抗体的研制及鉴定

用基因重组的丙肝病毒 ＮＳ５蛋白免疫Ｂａｌ ｂ／ｃ ／小鼠，制备免疫脾Ｂ淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤Ｓｐ２／０细胞系融合，筛选获得了１株能分泌抗 ＮＳ５蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该株单克隆抗体为 ＩｇＧ１。ＥＬＩＳＡ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ证实该株单抗对 ＮＳ５蛋白有较好的特异性。

丙型肝炎病毒NS5B全长基因及截短形式基因的克隆、表达及鉴定

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达及鉴定。方法利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因,经BamHI和XhoI双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,并进行纯化及鉴定。结果所构建的3种重组质粒pET-28a(+)-NS5B-FL、pET-28a(+)-NS5B-C21和pET-28a(+)-NS5B-C51,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经PCR及酶切鉴定,均能扩增或酶切出相应大小的目的基因片段,表达的6His-NS5B-FL融合蛋白主要以包涵体形式存在,而表达的6His-NS5B-C21和6His-NS5B-C51融合蛋白的可溶性明显增加。纯化的6His-NS5B-C21蛋白未发生降解,6His-NS5B-FL和6His-NS5B-C51蛋白发生了部分降解。纯化后的3种蛋白均能与丙肝患者血清发生反应。结论已成功构建了3种NS5B基因的重组表达载体,并获得了目的蛋白表达,为进一步抗HCV药物的筛选奠定基础。

中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定

构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复制的RNA聚合酶原核表达载体pET30aNS5b,并在大肠杆菌中获得NS5B聚合酶蛋白的高效表达,为建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型的方法创造条件。使用高保真Pfu DNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性血清中扩增出HCV NS5b RNA多聚酶全基因序列,经BamHI和SalI酶切,将其克隆至同样酶切的pET-30a载体中:转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。用抗HCV NS5b单克隆抗体做Western-Blot进行鉴定。结果表明构建了原核表达载体,pET30aNS5bpET30aNS5b明显表达出12-His-NS5b聚合酶蛋白。测序结果表明,与已发表的相关HCV NS5b RNA聚合酶序列比较,其核苷酸和氨基酸的同源性分别在69％～92.7％及88.8％～96.8％之间。在最佳表达条件下,可高效诱导表达融合蛋白(65kDa),最高表达量占菌体蛋白18.9％。Western-Blot结果显示表达蛋白为HCV NS5b酶。HCV聚合酶蛋白全长基因可以成功地克隆在pET-30a载体上并有效表达出目的蛋白,为研究建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型莫定了基础。

丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定

目的 :构建HCVns5b基因的重组原核表达质粒 ,并获得NS5B蛋白的高效表达 ,为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件 .方法 :利用PCR技术扩增HCVns5b基因 ,XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上 ,转化大肠杆菌JM 10 9菌株 ,获得阳性重组质粒pRSETA ns5b ,阳性质粒转化BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE和WesternBlot电泳进行鉴定 ,并以薄层扫描分析对其定量 .结果 :成功构建了HCVNS5B蛋白表达载体 pRSETA ns5b,经诱导明显表达出6His NS5B融合蛋白 ,表达产物主要以包涵体形式存在 ,表达量占菌体蛋白 2 5 % ,Western Blot结果显示表达蛋白保持活性 .结论 :HCVNS5B蛋白在体外得到了有效表达 .

Functional interplay among the flavivirus NS3 protease, helicase, and cofactors

Flaviviruses are positive-sense RNA viruses, and many are important human pathogens. Nonstructural protein 2B and 3 of the flaviviruses(NS2BNS3) form an endoplasmic reticulum(ER) membrane-associated hetero-dimeric complex through the NS2B transmembrane region. The NS2BNS3 complex is multifunctional. The N-terminal region of NS3, and its cofactor NS2B fold into a protease that is responsible for viral polyprotein processing, and the C-terminal domain of NS3 possesses NTPase/RNA helicase activities and is involved in viral RNA replication and virus particle formation. In addition, NS2BNS3 complex has also been shown to modulate viral pathogenesis and the host immune response. Because of the essential functions that the NS2BNS3 complex plays in the flavivirus life cycle, it is an attractive target for antiviral development. This review focuses on the recent biochemical and structural advances of NS2BNS3 and provides a brief update on the current status of drug development targeting this viral protein complex.

登革病毒复制分子机制的研究进展

登革病毒（dengue virus,DV）是登革热（dengue fever,DF）、登革出血热/登革休克综合征（DHF/DSS）的病原体,按血清型分为四型（DV1～4）。DV以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介,广泛流行于全球热带及亚热带的60多个国家和地区[1]。