术前血清V-set和免疫球蛋白结构域4以及长链非编码核糖核酸SBF2反义RNA1与肾结石患者经皮肾镜取石术后急性肾损伤的关系

目的探讨术前血清V-set和免疫球蛋白结构域4(VSIG4)以及长链非编码核糖核酸(LncRNA)SBF2反义RNA1(SBF2-AS1)与肾结石患者经皮肾镜取石术后急性肾损伤(AKI)的关系。方法选择2020年1月—2022年12月本院收治的109例肾结石患者为研究对象。术前检测患者血清VSIG4水平以及LncRNA SBF2-AS1表达,术后记录AKI发生情况。采用多因素Logistic回归模型分析肾结石患者经皮肾镜取石术后发生AKI的影响因素;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析VSIG4、LncRNA SBF2-AS1预测肾结石患者经皮肾镜取石术后发生AKI的价值。结果本研究中,术后发生AKI者16例。AKI组血清VSIG4水平低于非AKI组,LncRNA SBF2-AS1表达高于非AKI组,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,术前高尿酸水平、术前高LncRNA SBF2-AS1表达、较长的手术时间、术中低血压是肾结石患者经皮肾镜取石术后发生AKI的危险因素(P<0.05),术前高VSIG4水平是保护因素(P<0.05)。术前血清VSIG4、LncRNA SBF2-AS1水平预测肾结石患者经皮肾镜术后发生AKI的曲线下面积分别为0.854、0.705,二者联合预测的曲线下面积为0.948,大于各指标单独预测(Z=1.995、2.958,P<0.05)。结论肾结石患者术前血清VSIG4水平降低、LncRNA SBF2-AS1表达增高与经皮肾镜取石术后AKI的发生有关,联合检测术前VSIG4、LncRNA SBF2-AS1可预测术后AKI的发生风险。

依托咪酯通过下调含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2表达抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨依托咪酯(ETO)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖和凋亡的影响及含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)在其中发挥的作用机制。方法分别采用0、1、2和3 mg/L的ETO处理人正常肺上皮细胞系BESA-2B和人NSCLC细胞系A549,细胞计数试剂盒法检测细胞活力;将A549细胞随机分为对照组、ETO(3 mg/L)组、ETO+NC组和ETO+WWP2-OE组,后2组分别于ETO处理后转染空载体pcDNA3.1-NC或WWP2过表达载体pcDNA3.1-WWP2,集落形成试验检测细胞增殖能力;TUNEL染色检测细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞中WWP2的mRNA表达;STITCH数据库选择与ETO直接相互作用的蛋白质;蛋白质印迹法检测各组细胞中WWP2、增殖、凋亡和磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路相关蛋白表达。结果ETO以剂量依赖性方式显著降低A549细胞活力(F=147.923,P<0.001);而对正常肺上皮BESA-2B细胞活力无影响(F=1.427,P=0.126)。不同浓度(0、1、2、3 mg/L)ETO处理A549细胞后,集落形成数量逐渐减少[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(898±38)、(785±48)、(635±36)、(388±20)个],细胞凋亡率逐渐升高[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(2.23±0.65)%、(7.63±0.35)%、(13.24±0.47)%、(18.93±0.36)%],呈剂量依赖性(F=218.732、352.786,均P<0.001)。STITCH数据库预测ETO可通过上调WWP2蛋白表达和下调PTEN蛋白表达与WWP2和PTEN相互作用。与对照组相比,ETO组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达降低,集落形成数量减少,细胞凋亡率升高,增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞增殖抗原Ki67、B淋巴细胞瘤基因2(Bcl-2)和PTEN蛋白表达降低,Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)蛋白表达升高,磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K和磷酸化Akt(p-Akt)/Akt比值降低(均P<0.01);与ETO+NC组比较,ETO+WWP2-OE组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达升高,集落形成数量增多,细胞凋亡率降低,PCNA、Ki67、Bcl-2和PTEN蛋白表达增多,Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达减少,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值升高(均P<0.01)。结论ETO可抑制A549细胞增殖并促进细胞凋亡,其作用机制可能与调控WWP2的下调和PTEN/PI3K/Akt通路的激活有关。

血清可溶性CD36、抵抗素、能量平衡相关蛋白联合预测2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的价值探讨

目的探讨血清可溶性CD36(sCD36)、抵抗素、能量平衡相关蛋白(Adropin)联合对2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的预测价值。方法前瞻性选取石家庄市第二医院2018年5月至2021年5月收治的90例T2DM合并NAFLD病人(A组)、90例单纯T2DM病人(B组),同期选取90例体检健康者(对照组)作为研究对象。通过酶联免疫吸附测定检测研究对象血清sCD36、抵抗素、Adropin表达水平,对比分析三组sCD36、抵抗素、Adropin表达水平差异;分析sCD36、抵抗素、Adropin表达相关性;logistic回归分析T2DM合并NAFLD的影响因素;受试者操作特征曲线(ROC曲线)分析sCD36、抵抗素、Adropin三者联合对T2DM合并NAFLD的预测价值。结果A组病人血清sCD36(63.7±15.6)ng/L、抵抗素(3.15±0.46)μg/L水平均高于B组[(43.8±14.2)ng/L、(2.72±0.68)μg/L]和对照组[(22.9±5.7)ng/L、(2.58±0.39)μg/L](P<0.05),血清Adropin水平(66.28±27.62)ng/L均低于B组(86.73±25.46)ng/L和对照组(128.59±45.22)ng/L,差异有统计学意义(P<0.05)。sCD36与抵抗素表达水平呈正相关(r=0.29,P<0.05),Adropin与sCD36表达呈负相关(r=−0.57,P<0.05)。logistic回归分析显示,sCD36,抵抗素,总胆固醇(TC)是T2DM合并NAFLD的影响因素(P<0.05)。ROC曲线分析显示,sCD36、抵抗素、Adropin单独及三者联合预测T2DM合并NAFLD的曲线下面积(AUC)分别为0.81、0.74、0.72、0.89,三者联合对T2DM合并NAFLD的预测效能显著高于单指标独立预测(P<0.05)。结论T2DM合并NAFLD病人血清sCD36、抵抗素水平升高,Adropin水平降低,三者联合对预测T2DM合并NAFLD具有较高效能。

衔接蛋白失能同源物2通过抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3对结核性胸膜炎大鼠炎症和氧化应激的影响

目的:探讨衔接蛋白失能同源物2(DAB2)抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)对结核性胸膜炎大鼠炎症和氧化应激的影响。方法:按照随机数字法将60只SPF级雄性SD大鼠分为四组,每组40只。除正常对照组外,结核性胸膜炎组、DAB2组和pcDNA-NLRP3组进行建模处理,以第2天是否抽出胸腔积液为模型建立成功。正常对照组不注射结核分枝杆菌H37RV悬液,DAB2组建模后第2天静脉注射AAV9-DAB2质粒,每天1次,连续注射7 d,DAB2+pcDNA-NLRP3组在注射AAV9-DAB2质粒500μg/L的同时注射pcDNA-NLRP380μl,正常对照组和结核性胸膜炎组的大鼠尾静脉注射0.9%氯化钠溶液。进行各组呼吸功能指标测定,收集胸腔积液,记录积液量,观察3、5、7 d的胸腔积液粘连性情况,HE染色观察胸膜组织病理学情况,Western blot检测胸膜组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)和MMP-9蛋白表达,荧光探针DCFH-DA分析检测活性氧(ROS)的水平。结果:与正常组相比,结核性胸膜炎组的大鼠的胸腔积液和胸膜厚度明显增加,用力肺活量(FVC)、最大呼气流量(PEF)、用力呼气容积(FEV)0.3和FEV0.3/FVC显著降低,TNF-α、IL-8、MMP-1和MMP-9蛋白表达显著升高,基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)蛋白表达显著降低,丙二醛(MDA)水平升高,超氧化物歧化酶(SOD)水平降低,ROS累积量明显升高(均P<0.001);与结核性胸膜炎组相比,DAB2组大鼠胸腔积液和胸膜厚度显著降低,FVC、PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC明显升高,DAB2组大鼠胸膜组织中的TNF-α、IL-8、MMP-1和MMP-9蛋白表达明显降低,TIMP-1水平明显升高,MDA水平降低,SOD水平升高,ROS累积量明显降低(均P<0.001);与DAB2组相比,DAB2+pcDNA-NLRP3组大鼠胸腔积液和胸膜厚度明显升高,FVC、PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC明显降低,DAB2+pcDNA-NLRP3组的TNF-α、IL-8、MMP-1和MMP-9蛋白表达明显升高,TIMP-1蛋白表达显著降低,MDA水平明显升高,SOD水平显著降低,ROS累积量显著升高(均P<0.001),各组大鼠在3、5、7 d的胸腔积液粘连性评分比较采用重复测量设计的方差分析,结果显示,不同时间点的胸腔积液粘连性评分比较差异具有统计学意义(均P<0.001);各组胸腔积液粘连性评分比较差异具有统计学意义(均P<0.001);各组胸腔积液粘连性评分变化趋势比较差异有统计学意义(均P<0.001);与模型组相比,DAB2组大鼠的胸膜内和肺间质内血管充血症状减轻,有少量的纤维组织增生,上皮样细胞团以及凝固型坏死也明显减少,淋巴细胞和中性粒细胞浸润也明显减少;与DAB2组相比,DAB2+pcDNA-NLRP3组大鼠的胸膜内和肺间质内血管充血症状加重,出现的纤维组织增生,上皮样细胞团以及凝固型坏死也明显增多,淋巴细胞和中性粒细胞浸润也明显增加。结论:DAB2通过抑制NLRP3的活性促进胸腔积液的吸收,降低胸膜厚度和粘连发生率,降低炎症反应和氧化应激水平,缓解结核性胸膜炎的进展。

YTH结构域家族蛋白2和叉头蛋白转录因子3在肺腺癌中的表达关系研究

目的 分析YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)及叉头蛋白转录因子3(FOXO3)在肺腺癌病人中的表达及与预后的关系。方法 收集2020年1月至2021年5月在郑州大学第一附属医院行手术治疗的肺腺癌病人癌组织及对应的癌旁组织(距离癌组织5 cm以上)80对,收集病人临床病理资料;利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库查询YTHDF2、FOXO3基因在肺腺癌中的表达水平;采用免疫组织化学法检测YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌组织中的表达情况;分析YTHDF2、FOXO3蛋白水平与肺腺癌病人临床病理资料的关系;分析肺腺癌中YTHDF2与FOXO3基因表达水平的相关性;对病人进行为期3年的随访,分析病人3年累积生存率。结果 YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌组织中的高表达率分别为34.00%、26.00%,明显低于癌旁正常组织中79.48%、61.54%(P<0.05)。YTHDF2蛋白表达情况与肺腺癌病人年龄、淋巴结转移和分化程度相关(P<0.05);与TNM分期、性别无关(P>0.05);FOXO3蛋白表达情况与肺腺癌病人性别和分化程度相关(P<0.05);肺腺癌组织中YTHDF2蛋白高表达组和低表达组病人3年累积生存率分别为53.30%、14.00%,经log-rank比较,差异有统计学意义(P<0.05);FOXO3蛋白高表达组和低表达组病人3年累积生存率分别为64.50%、12.20%,经Log-Rank比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 YTHDF2、FOXO3在肺腺癌组织中均低表达,与病人肿瘤分化程度及3年累积生存率有关,有望成为评估肺腺癌病人预后的生物标志物。

2型糖尿病患者脑结构与糖化血红蛋白关系的影像学研究进展

2型糖尿病是一种常见的代谢性疾病,可引起多个器官系统的并发症,包括对大脑结构的影响。随着影像学技术的发展,研究人员能够通过结构磁共振成像(structural magnetic resonance imaging,sMRI)、功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging,fMRI)和脑电图(electroencephalogram,EEG)等方法直观地评估2型糖尿病患者的脑结构和功能。本文综述了近期基于影像学技术的研究进展,重点探讨了2型糖尿病患者脑结构与糖化血红蛋白之间的关系,并讨论了未来的研究方向。

免疫检查点T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域、人内源性逆转录病毒-H长端重复相关蛋白2在子宫内膜癌中的表达及临床意义

目的分析免疫检查点T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域(VISTA)、人内源性逆转录病毒-H长端重复相关蛋白2(HHLA2)在子宫内膜癌(EC)中的表达及临床意义。方法选取2017年9月至2019年10月唐山市妇幼保健院收治的120例的EC患者作为研究对象,收集其的EC组织和癌旁正常组织。检测EC组织和癌旁正常组织VISTA、HHLA2的表达;采用Spearman分析免疫检查点VISTA、HHLA2的相关性;Kaplan-Meier分析VISTA、HHLA2与预后的关系;Cox回归分析影响EC患者预后的危险因素。结果EC组织中VISTA、HHLA2阳性表达率显著高于正常癌旁组织(P<0.05)。Spearman相关性结果显示EC组织中VISTA与HHLA2表达呈正相关性(r=0.587,P<0.05)。EC组织中VISTA、HHLA2表达与临床病理特征有关(P<0.05)。Kaplan-Meier曲线结果显示VISTA阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(χ^(2)=11.864,P<0.05),HHLA2阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(χ^(2)=4.975,P<0.05)。Cox回归分析结果显示VISTA和HHLA2是影响EC患者预后的危险因素(P<0.05)。结论免疫检查点VISTA、HHLA2在EC中高表达,其是影响EC预后的危险因素,二者可能是有价值的预后标志物。

抑制抗增殖蛋白2增强非小细胞肺癌细胞系A549对厄洛替尼敏感性

目的探讨抗增殖蛋白2(PHB2)在非小细胞肺癌细胞系A549对厄洛替尼(Erl)敏感性中的作用及其机制。方法在A549细胞中转染PHB2小干扰RNA(siPHB2),观察抑制PHB2表达对Erl诱导的细胞增殖和凋亡的影响。利用MitoTracker染色和感染绿色荧光蛋白-微管相关蛋白(GFP-LC3)观察微管相关蛋白(LC3)和线粒体共定位,EdU实验检测细胞增殖,平板集落检测细胞集落形成能力,TUNEL实验检测细胞凋亡,Western blot检测PHB2和LC3Ⅱ蛋白表达水平,用相应试剂盒检测线粒体膜电位、细胞色素c含量和呼吸链复合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅴ活性。结果与siPHB2组和siCtrl+Erl组相比,siPHB2+Erl组EdU阳性的细胞数显著减少(P<0.05),集落形成数显著减少(P<0.05),TUNEL阳性的细胞数显著增加(P<0.05),线粒体膜电位显著降低(P<0.05),线粒体呼吸链复合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅴ活性均显著降低(P<0.05),线粒体内细胞色素c减少(P<0.05),而细胞质内细胞色素c的增加(P<0.05)。结论抑制PHB2改善A549细胞对Erl的敏感性,其机制可能与抑制PHB2介导的线粒体自噬有关。

冠状病毒非结构蛋白Nsp2的演化、结构与功能

以新冠病毒(SARS-CoV-2)为代表的冠状病毒(coronavirus,CoV)主要危害呼吸系统和消化道系统,严重危害人类与动物健康。冠状病毒非结构蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)是病毒基因Orf1ab编码的多聚蛋白质在病毒木瓜样蛋白酶作用下,经切割后形成的成熟加工产物。Nsp2的研究较少,其在病毒复制相关的生命周期、与宿主相互作用等过程中发挥的主要作用至今未得到阐明。尽管Nsp2在不同CoVs中变异程度较大,但其演化分型与不同冠状病毒亚属的分型一致。最近对SARS-CoV-2 Nsp2的高级结构进行了解析和分析,同时也发现了SARS-CoV-2 Nsp2上存在一些与新冠突变株相关的显著突变,但是对Nsp2结构与突变及其生物学功能的联系仍不清楚。虽然Nsp2对于冠状病毒复制是非必须的,但是对于野生毒株达到最大病毒复制量至关重要。Nsp2被招募到被感染细胞的双层膜囊泡结构,与多种病毒蛋白质相互作用,协同参与病毒复制与转录。Nsp2还通过与多种宿主蛋白质相互作用,不仅参与线粒体、溶酶体、内质网等细胞器的生理过程,调节宿主细胞的能量代谢与物质转运,还通过影响干扰素的产生调节宿主先天免疫应答。本文对冠状病毒,特别是新冠病毒的Nsp2的产生、遗传演化、结构、主要变异位点进行了归纳,同时对其参与病毒复制、与病毒蛋白质及宿主蛋白质互作等最新研究进行概述总结,以期为冠状病毒的病原生物学、致病机制研究与防控提供参考。

SARS-CoV-2非结构蛋白Nsp2上调A549细胞泛素水平并被泛素化修饰研究

目的 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)因其强大的感染力肆虐全球,因此深入研究病毒与宿主的相互作用是揭示SARS-CoV-2致病机制的重要途经。方法 利用同源重组方法 将SRAS-CoV-2的非结构蛋白Nsp1~Nsp16构建到真核表达载体上,并通过Western blot检测Nsp1~Nsp16重组质粒的蛋白表达情况。接着使用Western blot检测Nsp2对细胞总泛素水平的影响,并通过细胞免疫荧光检测Nsp2在细胞中的分布情况。最后通过免疫共沉淀技术对Nsp2与泛素之间的相互作用关系进行检测。结果 Western blot检测显示Nsp1~Nsp16重组质粒能够在A549细胞中正常表达;筛选发现非结构蛋白Nsp2能在细胞质中上调细胞总泛素表达水平;免疫共沉淀检测进一步发现Nsp2能与泛素蛋白发生相互作用。结论 成功构建了SARS-CoV-2非结构蛋白Nsp1~Nsp16真核细胞表达载体,并发现非结构蛋白Nsp2可以增加细胞总泛素表达水平并被泛素化修饰。提示Nsp2通过泛素途径参与到SARS-CoV-2与宿主的相互作用,有助于深入了解病毒与宿主的作用机制。

A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。

含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2变构抑制剂缓解放射性肺炎的作用效应与机制研究

目的探索含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)变构抑制剂对放射性肺炎的缓解作用及其可能的机制。方法以50 Gy的剂量进行双肺辐照建立辐射诱导放射性肺炎小鼠模型,分别提取SHP2变构位点抑制剂SHP099辐照组(辐照并予以SHP099灌胃)、辐照组(辐照未灌胃)、SHP099未辐照组(未辐照并予以SHP099灌胃)和对照组(未辐照且未灌胃)小鼠的肺组织制作HE切片。通过实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测4组小鼠肺组织内炎性反应因子诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的mRNA水平。RT-qPCR检测小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7和骨髓原代巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)中iNOS、TNF-α和IL-6的表达情况。收集BMDM培养上清采用酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测TNF-α和IL-6的分泌情况。通过流式细胞术分析辐照后不同培养时间后RAW264.7和BMDM细胞产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平。采用RT-qPCR检测10 Gy辐照后24 h RAW264.7细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidase,NOX)各亚基和同系物表达水平变化。采用蛋白质印迹法检测RAW264.7细胞中NOX4表达水平。结果通过SHP099灌胃辐射小鼠模型发现,SHP099预处理的辐照小鼠肺部损伤减弱,肺组织内炎性反应因子iNOS、TNF-α和IL-6的mRNA表达均下调(均P<0.05)。10 mmol/L SHP099预处理24 h后,RAW264.7和BMDM细胞因10 Gy辐照引起的上升的炎性反应因子iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA表达均下降(均P<0.05)。收集BMDM细胞的培养上清显示,SHP099预处理也可减少辐照后TNF-α和IL-6蛋白的分泌(均P<0.05)。SHP099预处理也可降低10 Gy辐照后30 min引起的RAW264.7和BMDM细胞升高的ROS水平(均P<0.05)。采用RT-qPCR检测RAW264.7细胞10 Gy辐照后24 h NOX各个亚基和同系物的表达变化情况显示,p22^(phox)、p40^(phox)、Rac1、NOX2、NOX3、NOX4和NOX5表达均上调(均P<0.05),其中NOX4上调最多;而SHP099预处理可减少辐照后RAW264.7细胞的NOX4蛋白表达(P<0.01)。结论SHP2变构抑制剂可以缓解辐照诱导的小鼠肺部炎性反应。SHP2变构抑制剂可能是通过抑制巨噬细胞中NOX4的表达降低ROS产生,从而减少炎性反应因子分泌。

长链非编码RNA淋巴细胞白血病缺失基因2/微小RNA-30c-5p/丝裂原活化蛋白激酶1轴在食管癌细胞紫杉醇耐药中的作用机制实验研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)淋巴细胞白血病缺失基因2(DLEU2)/微小RNA(miR)-30c-5p/丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)轴在食管癌细胞紫杉醇(PTX)耐药中的作用机制。方法:构建EC109/PTX细胞,检测食管癌组织和癌旁正常组织,以及食管癌细胞EC109和KYSE150细胞、食管上皮细胞SHEE和EC109/PTX细胞DLEU2、miR-30c-5p、MAPK1 mRNA表达。取生长良好的EC109/PTX细胞,分为沉默(siRNA)DLEU2组、阴性对照(siRNA NC)组、siRNA DLEU2+miR-30c-5p抑制剂(inhibitor)组、siRNA DLEU2+inhibitor NC组、siRNA DLEU2+过表达(pcDNA)MAPK1组、siRNA DLEU2+pcDNA NC组和空白组。验证miR-30c-5p与DLEU2、MAPK1的靶向关系。检测各组EC109/PTX细胞DLEU2、miR-30c-5p、MAPK1 mRNA表达水平。检测EC109/PTX细胞活性、凋亡情况及对PTX的耐药性。检测谷胱甘肽S-转移酶π(GST-π)、MAPK1、P-蛋白(P-gp)蛋白表达水平。结果:食管癌组织和EC109/PTX细胞miR-30c-5p表达降低,DLEU2、MAPK1 mRNA表达增加(均P<0.05)。DLEU2靶向调控miR-30c-5p,miR-30c-5p靶向调控MAPK1。siRNA DLEU2组miR-30c-5p表达和细胞凋亡率较siRNA NC组、空白组增加,DLEU2和MAPK1 mRNA表达、细胞增殖率、药物半数抑制浓度(IC 50)以及GST-π、MAPK1、P-gp蛋白表达降低(均P<0.05)。siRNA DLEU2+miR-30c-5p inhibitor组miR-30c-5p表达和细胞凋亡率较siRNA DLEU2+inhibitor NC组降低,MAPK1 mRNA表达、细胞增殖率、IC 50以及GST-π、MAPK1、P-gp蛋白表达增加(均P<0.05)。siRNA DLEU2+pcDNA MAPK1组细胞凋亡率较siRNA DLEU2+pcDNA NC组降低,MAPK1 mRNA表达、细胞增殖率、IC 50以及GST-π、MAPK1、P-gp蛋白表达增加(均P<0.05)。结论:干扰lncRNA DLEU2可减弱EC109/PTX细胞对PTX的耐药性,可能与调控miR-30c-5p/MAPK1轴有关。

长链非编码RNA NUTM2A-AS1靶向微小RNA-129-5p调控氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)NUTM2A-AS1对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的血管内皮细胞损伤的影响及分子机制。方法 将人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在DMEM培养基中培养,采用100μg/mL oxLDL处理的HUVEC纳入oxLDL组,常规培养的细胞纳入Con组。将lncRNA NUTM2A-AS1干扰表达载体及阴性对照、miR-129-5p模拟物及阴性对照转染至HUVEC后采用100μg/mL oxLDL处理后的细胞分别纳入oxLDL+si-NUTM2A-AS1组、oxLDL+si-NC组、oxLDL+miR-129-5p组、oxLDL+miR-NC组。将lncRNA NUTM2A-AS1干扰表达载体与微小RNA(miR)-129-5p抑制剂或阴性对照共转染至HUVEC后采用100μg/mL的oxLDL处理的细胞分别纳入oxLDL+si-NUTM2A-AS1+anti-miR-129-5p组、oxLDL+si-NUTM2A-AS1+anti-miR-NC组。采用试剂盒测量细胞中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;采用流式细胞术检测细胞凋亡;采用蛋白质印迹法检测蛋白表达;采用双荧光素酶报告实验及RNA下拉实验检测NUTM2A-AS1与miR-129-5p的靶向关系。结果 与Con组比较,oxLDL组lncRNA NUTM2A-AS1表达水平升高,miR-129-5p表达水平降低,MDA含量升高,SOD、GSH-Px活性降低,血管内皮细胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。干扰lncRNA NUTM2A-AS1表达或过表达miR-129-5p后,MDA含量降低,SOD、GSH-Px活性升高,细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。lncRNA NUTM2A-AS1敲低介导的oxLDL条件下血管内皮细胞的损伤抑制可以被miR-129-5p下调逆转。lncRNA NUTM2A-AS1靶向调控miR-129-5p。结论 干扰lncRNA NUTM2A-AS1表达通过靶向上调miR-129-5p抑制oxLDL诱导的血管内皮细胞损伤。

卷曲螺旋结构域蛋白2通过促进线粒体自噬抑制帕金森病SH-SY5Y细胞凋亡

背景:卷曲螺旋结构域蛋白2(coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing 2,CHCHD2)能否调控PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在帕金森病中发挥神经保护作用尚未可知。目的:探讨CHCHD2在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中对PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬发挥的作用及机制。方法:利用重组质粒转染技术过表达或敲低CHCHD2,用6-羟基多巴胺构建SH-SY5Y细胞帕金森病模型后分对照组、模型组、过表达阴性对照+6-羟基多巴胺组、敲低阴性对照+6-羟基多巴胺组、过表达CHCHD2+6-羟基多巴胺组和敲低CHCHD2+6-羟基多巴胺组。Western blot及RT-qPCR检测CHCHD2的表达;Western blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、MFN1、COXⅣ、DRP1、PINK1、Parkin、TIM23、Bax、Bcl-2及cleavedcaspase3蛋白表达;CCK-8、JC-1和活性氧试剂盒检测细胞活性、线粒体膜电位和活性氧水平,单丹磺酰尸胺染色观察细胞自噬情况,透射电镜观察自噬溶酶体。结果与结论:①与对照组相比,模型组细胞活性、线粒体膜电位及CHCHD2、PINK1、Parkin蛋白表达降低,活性氧水平、凋亡水平及LC3Ⅰ/Ⅱ、p62蛋白表达升高(P<0.05),并观察到自噬溶酶体的存在;②与模型组相比,过表达CHCHD2能降低细胞活性氧水平,升高线粒体膜电位及PINK1、Parkin和MFN1蛋白表达水平,并观察到线粒体自噬溶酶体增多,而敲低CHCHD2后有与上述相反的作用,并伴有COXⅣ、TIM23和p-DRP1蛋白表达的升高(P<0.05);③与模型组相比,过表达CHCHD2能减少细胞凋亡,上调Bcl-2并下调Bax及cleavedcaspase3蛋白的表达,而敲低CHCHD2后有与上述相反的作用(P<0.05);④结果提示,CHCHD2在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中可以通过促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬改善线粒体功能从而减轻细胞凋亡发挥神经保护作用。

沉默YTH结构域家族蛋白2改善血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠原代心肌细胞肥大与凋亡

目的探讨YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的新生大鼠原代心肌细胞肥大和凋亡的影响。方法为探讨AngⅡ刺激下YTHDF2的表达水平,将细胞分为正常组和AngⅡ组。为探讨沉默YTHDF2对心肌细胞肥大与凋亡的影响,将细胞分为4组,空白组[转染阴性对照小干扰RNA(siRNA)+PBS]、siYTHDF2组[转染YTHDF2 siRNA(siYTHDF2)+PBS]、模型组(siRNA+AngⅡ)和实验组(siYTHDF2+AngⅡ)。用Western blot和逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测YTHDF2基因表达水平,RT-qPCR检测心肌肥厚相关基因心房钠尿肽(ANP)、B型钠尿肽(BNP)和β肌球蛋白重链(β-MHC)及心肌细胞凋亡相关基因Bax、B淋巴细胞瘤2基因(Bcl-2)mRNA的表达水平,免疫荧光染色观察心肌细胞表面积,原位末端标记法染色观察心肌细胞凋亡情况,免疫沉淀反应验证YTHDF2和Bcl-2的结合关系。结果AngⅡ组YTHDF2蛋白表达及mRNA水平显著高于正常组(1.49±0.03 vs 0.97±0.09,1.50±0.08 vs 1.00±0.07,P<0.05)。与空白组比较,模型组心肌细胞表面积增大,细胞凋亡率升高,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显升高,Bcl-2 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与模型组比较,实验组心肌细胞表面积减小,细胞凋亡率降低,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显降低,Bcl-2 mRNA表达明显升高(P<0.05)。结论沉默YTHDF2可以缓解AngⅡ诱导的大鼠原代心肌细胞肥大与凋亡,YTHDF2通过与Bcl-2相结合抑制其表达水平。

非小细胞肺癌患者组织MutS同种组织蛋白2、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶表达分析

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者癌组织MutS同种组织蛋白2(MSH2)、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)表达情况及与临床病理参数、预后的关系。方法2021年7月至2022年7月我院收治的96例NSCLC患者,取其手术切除的NSCLC组织标本(NSCLC组)及距癌边缘3 cm处的癌旁正常组织(对照组)。检测两组MSH2和MGMT的表达水平,分析MSH2和MGMT表达水平与患者临床病理参数及预后的关系。结果与对照组比较,NSCLC组MSH2和MGMT阳性率更低(P<0.05);MSH2阳性与患者分化程度有关(P<0.05);MGMT阳性与患者吸烟史和分化程度有关(P<0.05);与MSH2和MGMT阴性患者比较,阳性患者1年生存率均更高(P<0.05)。结论MSH2和MGMT均在NSCLC组织中存在较低表达,其表达水平与临床病理参数、预后密切相关。

含jumonji结构域的蛋白2B和缺氧诱导因子1α在儿童非霍奇金淋巴瘤组织中的表达及意义

目的探讨含jumonji结构域的蛋白2B(jumonji domain-containing protein 2B,JMJD2B)和缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-lα)在儿童非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma,NHL)组织中的表达和意义。方法应用免疫组化检测46例NHL儿童(观察组)和24例反应性增生儿童(对照组)淋巴结组织标本中JMJD2B和HIF-1α的表达,分析JMJD2B和HIF-1α与NHL患儿临床病理特征和预后的关系,以及在NHL组织中JMJD2B和HIF-1α表达的相关性。结果观察组JMJD2B(87%vs 21%)和HIF-1α(83%vs 42%)表达阳性率均高于对照组(P<0.05)。JMJD2B和HIF-1α表达与NHL患儿血清乳酸脱氢酶水平和国际预后指数危险度相关(P<0.05)。JMJD2B与HIF-1α在NHL患儿组织中的表达呈正相关(rs=0.333,P=0.024)。结论JMJD2B和HIF-1α在儿童NHL组织中表达增高,二者在儿童NHL发生发展过程中可能起协同作用;JMJD2B可作为儿童NHL辅助诊断、评估病情、指导治疗、评估预后的新指标.

SARS-CoV-2主蛋白酶的表达、纯化和一种新型晶体结构的研究

新型冠状病毒SARS-CoV-2的主蛋白酶(Main Protease, Mpro),也称为3-糜蛋白酶样蛋白酶(3CLpro),在病毒复制的过程中发挥核心作用。Mpro的结构和功能在β-冠状病毒中相对保守,在人体内没有同源蛋白,因此是抗病毒药物开发的关键靶点。本研究完成了SARS-CoV-2 Mpro的原核表达与纯化,获得具有高纯度和高均一性的蛋白质样品。利用气相扩散坐滴法开展了Mpro的结晶筛选,获得单晶体后将其浸泡在由谷胱甘肽包裹的金团簇纳米材料溶液中,成功解析了仅有第156位半胱氨酸结合一个金离子的一个新型X射线衍射晶体结构。结构分析发现,Mpro蛋白的Cys156结合金离子后Asp153~Cys156区域的构象发生了~0.6 Å的偏移,推测该构象变化进一步通过变构效应抑制Mpro的生物功能,为新冠病毒的纳米型抑制剂的研发提供了新的信息。

pBD-2对热应激致小鼠小肠形态结构损伤及紧密连接蛋白表达的修复作用

为了研究猪β-防御素-2(porcinβ-defensin2,pBD-2)对热应激致小鼠小肠形态结构损伤及紧密连接蛋白表达的修复作用,试验将36只1月龄昆明小鼠随机分为空白对照组、热应激组和热应激+pBD-2组,每组12只。空白对照组和热应激组每天每只小鼠按体重10μL/g以灌胃的方式给予生理盐水,热应激+pBD-2组每天每只小鼠按体重0.01μg/g以灌胃的方式给予pBD-2。灌胃后将热应激组和热应激+pBD-2组放入40℃温箱热应激处理1 h,取出后与空白对照组一起放置于室温下进行饲养。按照相同的方式共处理28 d,并于第28天处理后断颈处死。每天灌胃前观察各组的行为,记录采食量并称重,试验结束后计算各组平均日采食量和平均日增重,并对小鼠进行剖检,分别取十二指肠、空肠、回肠组织进行石蜡切片制作和H.E.染色,比较各组肠绒毛高度与隐窝深度比值和单位面积内杯状细胞数目,并采用免疫组织化学技术对紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-3和Occludin进行检测与相对表达量分析。结果表明:试验期间,空白对照组无异样行为;热应激组探索行为增加,焦虑好动;热应激+pBD-2组比热应激组安静。热应激组平均日采食量显著高于热应激+pBD-2组和空白对照组(P<0.05),而热应激+pBD-2组和空白对照组间差异不显著(P>0.05)。空白对照组和热应激+pBD-2组平均日增重显著高于热应激组(P<0.05),空白对照组和热应激+pBD-2组平均日增重差异不显著(P>0.05)。空白对照组肠道健康、无红肿,肠道内容物适中;热应激组肠道表面充血、红肿,肠道内容物较多;热应激+pBD-2组肠道无红肿现象,肠道内容物较少。热应激组十二指肠、空肠、回肠绒毛高度与隐窝深度比值均显著低于空白对照组和热应激+pBD-2组(P<0.05),空白对照组和热应激+pBD-2组间差异不显著(P>0.05)。热应激+pBD-2组十二指肠和空肠单位面积内杯状细胞数量显著高于空白对照组和热应激组(P<0.05),空白对照组显著高于热应激组(P<0.05);热应激+pBD-2组回肠单位面积内杯状细胞数量显著高于热应激组(P<0.05)且与空白对照组间差异不显著(P>0.05),热应激组与空白对照组间差异不显著(P>0.05)。空白对照组和热应激+pBD-2组十二指肠、空肠和回肠中ZO-1蛋白的相对表达量显著高于热应激组(P<0.05),空白对照组和热应激+pBD-2组间差异不显著(P>0.05)。空白对照组十二指肠和空肠中Claudin-3蛋白的相对表达量显著高于热应激组和热应激+pBD-2组(P<0.05),热应激+pBD-2组显著高于热应激组(P<0.05);各组回肠中Claudin-3蛋白的相对表达量差异不显著(P>0.05)。空白对照组十二指肠中Occludin蛋白的相对表达量显著高于热应激组,但热应激+pBD-2组与空白对照组、热应激组均差异不显著(P>0.05);空白对照组和热应激+pBD-2组空肠和回肠中Occludin蛋白的相对表达量显著高于热应激组(P<0.05),但空白对照组和热应激+pBD-2组间差异不显著(P>0.05)。说明热应激处理会影响小鼠的消化吸收功能和小肠形态结构,降低小鼠小肠中紧密连接蛋白的表达量,而pBD-2对热应激造成的上述影响具有较好的修复作用。