检测猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3AB经纯化后作为抗原,建立了3AB间接ELISA方法,该方法可用于判定被检动物是否感染了口蹄疫病毒.重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以兔抗猪IgG/HRP酶结合物作为第2抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法.用该方法检测了大量不同背景的猪血清,并与3ABC-I-ELISA检测结果进行比较.结果表明:3AB-I-ELISA和3ABC-I-ELISA的总符合率为98.9%,而且3AB-I-ELISA的特异性高于3ABC-I-ELISA.

口蹄疫病毒O/Laos/00株非结构蛋白3A基因特征分析

经反转录聚合酶链式反应(RT_PCR)技术扩增得到口蹄疫病毒O/Laos/00株的非结构蛋白3A基因核苷酸序列,与其他8株代表性参考毒株的3A基因进行比较,分析口蹄疫病毒3A基因的特征。结果表明:O/Laos/00株3A基因含有429核苷酸,编码143氨基酸残基。9株病毒3A氨基酸序列相比较,可分成3种不同的类型:一类是具有全长3A的毒株,一类是具有133～143位氨基酸缺失的毒株,这两类毒株均来源于牛体,核苷酸差异小(<15%);另一类是具有93～102位氨基酸缺失的毒株,毒株相互之间核苷酸差异较大(7.25%～22.2%)。

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB单克隆抗体的制备及其对应表位区分析

为鉴定口蹄疫病毒(FMDV)的非结构蛋白3AB的抗原表位,本研究以原核表达并纯化的FMDV 3AB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,获得6株能够稳定分泌抗3AB蛋白特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞。这6株MAbs亚类鉴定均为IgG1型,轻链均为κ链。间接免疫荧光试验结果表明,这6株MAbs均能够识别FMDV 3AB蛋白。采用制备的MAb对分段表达的3AB蛋白进行western blot分析,结合位点分别位于3AB的第aa 55～aa 70、aa 64～aa 79、aa 130～aa 145区段。该结果为进一步探索3AB蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。

猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB基因在重组杆状病毒中的表达与鉴定

利用PCR方法扩增获得EMCV非结构蛋白3AB基因,并将其克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM中,提取阳性克隆质粒转化至DH10Bac感受态细菌,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacm id-3AB,经脂质体介导转染sf9细胞获得重组杆状病毒,并IFA和W estern b lotting鉴定其抗原性。结果表明,EMCV 3AB基因在昆虫细胞中获得成功表达,分子量约16 ku,具有良好的EMCV抗原性。因此利用杆状病毒表达系统成功表达了EMCV 3AB基因,为该病毒抗原表位和诊断方法研究奠定了重要基础。

口蹄疫非结构蛋白3ABC的融合表达及纯化研究

扩增了口蹄疫非结构蛋白 3ABC基因 ,经双酶切后与表达载体pQE30Xa连接 ,构建了重组质粒pQE3ABC ,并转化到宿主菌M15中进行表达 ,并对表达条件进行了优化。Western -blot结果表明 ,所表达的蛋白氨基酸序列正确 ,且表达的融合蛋白可与标准抗FMDV -O抗体特异性结合。本研究在大肠杆菌中成功地表达了口蹄疫非结构蛋白 3ABC 。

FMDV非结构蛋白3A和3B的表达与反应活性分析

根据已测得的O/China/99口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列,设计两对特异性表达引物,以带有O/Chi-na/99 3ABC基因片段的重组质粒pGEM-3ABC为模板,扩增得到了3A、3B基因,通过两端的BamHI和SalI酶切位点插入原核表达载体pET28a,将重组表达质粒转化宿主菌BL21,用IPTG诱导表达目的蛋白.表达产物经SDS-PAGE检测表明,3A和3B基因成功的在大肠埃希氏菌中得到了表达;通过Western blotting分析和斑点ELISA分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应.

猪传染性胃肠炎病毒非结构蛋白3a和3b融合表达及对细胞周期的影响

【目的】克隆及真核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)陕西分离株的3a和3b基因,研究表达蛋白在细胞中的分布及其对细胞周期的影响。【方法】利用软件Primer 5.0参照Genbank公布的序列设计两对分别针对TGEV非结构蛋白基因3a和3b的特异性引物。采用RT-PCR方法从TGEV陕西分离株克隆3a和3b基因,再将其与真核表达载体p EGFP-N1连接,构建真核表达质粒p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂质体转染法将重组质粒转染猪小肠黏膜上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC),采用激光共聚焦显微镜检测转染细胞内融合蛋白的表达分布情况。通过RT-PCR检测细胞中目的基因的转录情况,Western blotting检测细胞中融合蛋白的表达情况。利用流式细胞仪检测表达蛋白对细胞周期的影响,采用实时荧光定量PCR检测融合蛋白的表达对内质网应激蛋白标志性分子GRP78和细胞周期蛋白Cyclin A的表达的影响,通过Western blotting试验检测细胞中蛋白表达后GRP78、Cyclin A和Cyclin B1表达量的变化情况。【结果】成功克隆出完整的TGEV陕西分离株的3a及3b基因,经过测序鉴定,3a基因的大小为213bp,3b基因的大小为732bp;经过与不同来源的TGEV毒株进行对比分析,3a基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为97.4%—100%,氨基酸同源性为98.6%—100%;3b基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为98.3%—99.9%,氨基酸同源性为100%。重组表达载体转染IEC细胞后,经Western blotting分析IEC分别表达出分子质量约为35k D的3a-GFP和54k D的3b-GFP的融合蛋白,与预期结果相一致。激光共聚焦显微镜观察到融合蛋白3a-GFP和3b-GFP在IEC细胞的细胞核和细胞质中均有表达,流式细胞仪分析TGEV非结构蛋白3b的表达能够使G2/M期的细胞增多,实时荧光定量PCR分析显示细胞周期蛋白Cyclin A的m RNA水平高于对照组细胞(IEC和IEC-GFP),同时Western blotting分析结果显示表达3b蛋白的细胞中Cyclin A蛋白水平表达量高于对照组,并且Cyclin B1的表达量低于对照组细胞,差异显著;TGEV非结构蛋白3a对细胞周期没有影响。实时荧光定量PCR分析结果显示,表达TGEV非结构蛋白3a的细胞中GRP78的m RNA水平高于对照组,Western blotting分析GRP78的蛋白水平高于对照组,差异显著,说明非结构蛋白3a可以使GRP78表达水平的上调;TGEV非结构蛋白3b对GRP78的表达没有影响。【结论】TGEV陕西株的非结构蛋白3a和3b在IEC细胞中成功表达,3a蛋白可以引起细胞内质网应激反应,3b蛋白通过使细胞周期蛋白Cyclin A表达上调并且使Cyclin B1表达下调引起细胞周期阻滞于G2/M期。

猫冠状病毒非结构蛋白3的多克隆抗体制备及亚细胞定位

冠状病毒的非结构蛋白3(non-structural protein 3,Nsp3)是复制/转录复合体的组成部分,也是重要的潜在抗病毒靶标之一。本研究在对Nsp3进行跨膜区、信号肽和抗原表位预测的基础上,通过聚合酶链反应扩增Ⅱ型猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)代表毒株(WSU 79-1683)Nsp3蛋白中抗原性较好的区段(第50—550位氨基酸),随后将其亚克隆到pCOLD-TF原核表达载体上。在低温条件下,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,成功表达分子量约为130 kDa的His-Nsp3重组融合蛋白。在非变性条件下,采用镍柱亲和层析获得了纯度较高的目的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,制备Nsp3多克隆抗血清(多抗血清),蛋白质印迹法(Western blotting,WB)和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)结果显示,Nsp3多抗血清能特异性识别FCoV感染细胞中的Nsp3蛋白。采用免疫荧光双标法结合激光共聚焦显微镜对FCoV感染细胞中Nsp3蛋白的亚细胞定位进行分析,结果发现,FCoV感染细胞中Nsp3发生聚集现象,并与内质网存在共定位现象。Nsp3蛋白的特异性抗体制备以及亚细胞定位研究为进一步开展Nsp3蛋白的生物学功能分析奠定了基础。

检测口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体的斑点免疫金渗滤法的建立

为建立一种能够区分口蹄疫疫苗免疫与野毒感染动物的快速检测方法,将纯化的口蹄疫病毒3AB非结构蛋白抗原包被在硝酸纤维素膜上,加入待检血清样品后,利用胶体金标记SPA显色。应用斑点免疫金渗滤技术(DIGFA)和ELISA方法同时对150份猪血清进行检测,结果DIGFA法的阳性率为6%(9/150),ELISA法的阳性率为5.3%(8/150),两者符合率达99.3%。DIGFA操作简单,耗时短,结果易于判断,且与口蹄疫免疫猪血清、猪细小病毒、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应。结果表明,该法适用于生猪和牛等口蹄疫病毒3AB抗体的快速检测。

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因。方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1000 b插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因。结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。

基因表达谱芯片技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白3反式调节靶基因

目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白3(non-structural protein 3,NS3)是由HCV基因组编码的具有多种功能的蛋白质.NS3蛋白的表达对于HCV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响.为了研究NS3蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-NS3分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析.方法:以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染hepG2细胞之后有NS3蛋白的表达,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有34个基因表达水平显著上调,37个基因表达水平显著下调.结论:HCV的NS3蛋白是一种反式激活因子.NS3基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应(PCR)扩增丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3基因 ,克隆至真核表达载体pcDNA3 1(- )中 ,构建HCV NS3基因真核表达载体 pcDNA3 1(- ) NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法 (Westernblotting)检测转染细胞中HCVNS3蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pCAT3 promoter共转染HepG2细胞 ,用酶联免疫吸附方法 (ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果显示 ,质粒pcDNA3 1(- ) NS3在HepG2细胞瞬时表达HCVNS3蛋白 ,共转染实验中pcDNA3 1(- ) NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的 4 6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白 ,并能够反式激活SV4 0病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCVNS3蛋白反式激活的靶基因 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白 3人源单链可变区抗体的筛选与鉴定(英文)

目的筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 NS3的人单链可变区抗体 (Sc Fv) ,以解决人体内应用鼠单抗时的免疫原性问题 ,为进行抗 HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法采用噬菌体表面展示技术 ,以重组的 HCV非结构蛋白 NS3为固相抗原 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 -洗脱 -扩增”筛选过程 ,获得抗原结合活性较强的 HCVNS3人单链可变区抗体的阳性克隆 ,并对其进行免疫检测及序列测定。结果筛选出来的 Sc Fv片段具有抗 NS3的特异性。证实利用噬菌体抗体库技术 ,可以成功地获得 HCV NS3人单链抗体 Sc Fv的编码基因。结论筛选获得了 HCV非结构蛋白 NS3的特异性单链抗体的编码基因。

口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb)。方法:以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选,有限稀释法克隆,直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体,用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定。结果:免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选,共获得5株抗pET28a-3D的mAb,其亚类鉴定3株为IgG1,2株为IgG2b,初步判定所得5株mAb识别2个不同表位。Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDVO/China99感染的BHK-21细胞中的3D抗原均特异性结合,免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白。结论:成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb,为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白3全长基因的克隆和表达

目的克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3,为进一步研究其基因功能奠定基础。方法设计特异性引物,以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因。将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,经酶切、PCR及测序鉴定后,与表达载体pET32a重组,后转入BL21菌株并诱导表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS3基因的蛋白表达水平。结果含有NS3的重组体构建成功并在大肠杆菌中表达。结论运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV非结构基因NS3蛋白,为尽一步研究HCVNS3基因功能奠定了基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因6的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 3 (NS3 )是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因 ,我们应用微矩阵 (microarray)技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV H株cDNA的pBRTM 3 0 11质粒DNA作为模板 ,进行多聚酶链反应 (PCR)扩增 ,获得的HCVNS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 .1(-) NS3。以pcDNA3 .1(-) NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取总RNA ,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 (bioinformatics) ,克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3 .1(-) NS3 ,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3 .1(-) NS3转染HepG2后提取总RNA ,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS3反式激活的新型靶基因 ,命名为NS3TP6,新基因的编码基因序列全长为 414个核苷酸 (nt) ,编码产物由 13 8个氨基酸残基 (aa)组成。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因1的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术 (SSH )及生物信息学技术 (bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白 3(NS3 )反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3 1(-) NS3转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被NS3蛋白反式激活 ,故命名为NS3TP1,已在GenBank中注册 ,注册号为AY116969。NS3TP1基因的编码序列全长为 193 2个核苷酸 (nt) ,编码产物由 64 2个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白 ,HCVNS3反式激活作用的新靶基因的发现 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因2的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术 (SSH)及生物信息学技术 (bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白3 (NS3 )反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3 1(-) NS3转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被NS3蛋白反式激活 ,故命名为NS3TP2 ,在GenBank中注册 ,注册号为AY116970。NS3TP2基因的编码序列全长为 12 99个核苷酸 (nt) ,编码产物由43 2个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白 ,而抑制性消减杂交 (SSH)是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术。通过这种技术 ,发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因 ,这一发现 ,为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。

携带丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的重组腺病毒构建研究

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)的复制缺陷型重组腺病毒,为防治HCV感染的基因免疫和基因治疗提供实验基础。方法将HCV NS3基因定向克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组后,转染293细胞进行包装,并反复感染293细胞进行扩增。结果通过PCR扩增、酶切、核酸测序及Western杂交法检测鉴定,均证实插入穿梭质粒中的片段为HCV NS3基因(基因型1b);所包装出的复制缺陷型重组腺病毒AdEasy-GFP-NS3具有良好的感染能力,并可在293细胞中表达HCV NS3蛋白。结论AdEasy-GFP-NS3携带有HCV NS3基因,能有效地感染293细胞并高效表达,从而为丙型肝炎基因疫苗的进一步研究奠定了基础。

口蹄疫病毒非结构蛋白P3区的基因序列及分析

以口蹄疫Akesu/ 5 8分离株的 5 3代牛舌皮病料为材料 ,采用RT PCR法 ,扩增和克隆了两个约 1.5kb的DNA片段。核酸序列测得结果对接后 ,涵盖了全部P3区的基因序列。口蹄疫Akesu/ 5 8分离株基因组P3区的核酸序列共计 2 ,72 4nt,包括一个终止密码子TAA ,共编码 90 7个氨基酸 ;其中非结构蛋白 3A的基因是 45 9nt,编码 15 3个氨基酸 ;3个 3B(VPg)基因分别是 6 9、72和 72nt,氨基酸分别为 2 3、2 4和 2 4;3C是 6 39nt,2 13个氨基酸 ;3D是1,413nt ,471个氨基酸。各蛋白间由Glu/Gly(Ser)连接。序列比较显示 :3A的C端易变 。