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抗丙肝病毒NS5蛋白单克隆抗体的研制及鉴定 被引量:1
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作者 李越希 周宗安 +1 位作者 王永山 陶开华 《生物技术通讯》 CAS 1999年第4期274-275,共2页
用基因重组的丙肝病毒 NS5蛋白免疫Bal b/c /小鼠,制备免疫脾B淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞系融合,筛选获得了1株能分泌抗 NS5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该株单克隆抗体为 IgG1。ELISA及 We... 用基因重组的丙肝病毒 NS5蛋白免疫Bal b/c /小鼠,制备免疫脾B淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞系融合,筛选获得了1株能分泌抗 NS5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该株单克隆抗体为 IgG1。ELISA及 Western Blot证实该株单抗对 NS5蛋白有较好的特异性。 展开更多
关键词 丙肝病毒 非结构蛋白5区 单克隆抗体
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丙型肝炎病毒C端截短21个氨基酸NS5B蛋白的克隆、表达及鉴定 被引量:1
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作者 杨华凤 潘明洁 +1 位作者 吕敏 李越希 《药物生物技术》 CAS CSCD 2008年第2期86-89,共4页
构建HCV C端截短21个氨基酸的NS5B(HCV NS5B-C21)的重组原核表达质粒,并获得HCVNS5B-C21蛋白,为以其为靶位的抗HCV药物筛选等创造条件。利用PCR技术扩增HCVNS5B-C21基因,BamHⅠ和XhoⅠ双酶酶切后连接到经同样酶酶切的原核表达载体pET-28... 构建HCV C端截短21个氨基酸的NS5B(HCV NS5B-C21)的重组原核表达质粒,并获得HCVNS5B-C21蛋白,为以其为靶位的抗HCV药物筛选等创造条件。利用PCR技术扩增HCVNS5B-C21基因,BamHⅠ和XhoⅠ双酶酶切后连接到经同样酶酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得阳性重组质粒pET-28a(+)-NS5B-C21,IPTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白表达产物经SDS-PAGE进行鉴定。成功构建了HCV NS5B蛋白表达载体pET-28a(+)-NS5B-C21,经诱导明显表达出6His-NS5B-C21,截短形式的6His-NS5B-C21表达产物的可溶性明显增加。HCV NS5B-C21蛋白在体外得到了有效表达,表达的蛋白主要存在于上清液中,纯化获得了NS5B-C21蛋白,为抗HCV药物筛选等奠定基础。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 结构5B蛋白 RNA依赖的RNA聚合酶 克隆 表达
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丙型肝炎病毒NS5B全长基因及截短形式基因的克隆、表达及鉴定 被引量:5
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作者 杨华凤 潘明洁 +1 位作者 吕敏 李越希 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第1期1-4,共4页
目的构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达及鉴定。方法利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因,经BamHI和XhoI双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE... 目的构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达及鉴定。方法利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因,经BamHI和XhoI双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,并进行纯化及鉴定。结果所构建的3种重组质粒pET-28a(+)-NS5B-FL、pET-28a(+)-NS5B-C21和pET-28a(+)-NS5B-C51,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经PCR及酶切鉴定,均能扩增或酶切出相应大小的目的基因片段,表达的6His-NS5B-FL融合蛋白主要以包涵体形式存在,而表达的6His-NS5B-C21和6His-NS5B-C51融合蛋白的可溶性明显增加。纯化的6His-NS5B-C21蛋白未发生降解,6His-NS5B-FL和6His-NS5B-C51蛋白发生了部分降解。纯化后的3种蛋白均能与丙肝患者血清发生反应。结论已成功构建了3种NS5B基因的重组表达载体,并获得了目的蛋白表达,为进一步抗HCV药物的筛选奠定基础。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 结构5B蛋白 克隆 表达
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丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定 被引量:4
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作者 刘卫东 薛小平 +2 位作者 雷迎峰 尹文 吕欣 《第四军医大学学报》 北大核心 2003年第14期1265-1267,共3页
目的 :构建HCVns5b基因的重组原核表达质粒 ,并获得NS5B蛋白的高效表达 ,为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件 .方法 :利用PCR技术扩增HCVns5b基因 ,XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上 ,转... 目的 :构建HCVns5b基因的重组原核表达质粒 ,并获得NS5B蛋白的高效表达 ,为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件 .方法 :利用PCR技术扩增HCVns5b基因 ,XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上 ,转化大肠杆菌JM 10 9菌株 ,获得阳性重组质粒pRSETA ns5b ,阳性质粒转化BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE和WesternBlot电泳进行鉴定 ,并以薄层扫描分析对其定量 .结果 :成功构建了HCVNS5B蛋白表达载体 pRSETA ns5b,经诱导明显表达出6His NS5B融合蛋白 ,表达产物主要以包涵体形式存在 ,表达量占菌体蛋白 2 5 % ,Western Blot结果显示表达蛋白保持活性 .结论 :HCVNS5B蛋白在体外得到了有效表达 . 展开更多
关键词 C型肝炎样病毒属 结构5B蛋白 重组融合蛋白质类 基因表达
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中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定
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作者 杨振 蒋建东 +3 位作者 祁自柏 陈鸿珊 张华远 李河民 《中国病毒学》 CSCD 2003年第6期530-533,共4页
构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复制的RNA聚合酶原核表达载体pET30aNS5b,并在大肠杆菌中获得NS5B聚合酶蛋白的高效表达,为建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型的方法创造条件。使用高保真Pfu DNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HC... 构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复制的RNA聚合酶原核表达载体pET30aNS5b,并在大肠杆菌中获得NS5B聚合酶蛋白的高效表达,为建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型的方法创造条件。使用高保真Pfu DNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性血清中扩增出HCV NS5b RNA多聚酶全基因序列,经BamHI和SalI酶切,将其克隆至同样酶切的pET-30a载体中:转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。用抗HCV NS5b单克隆抗体做Western-Blot进行鉴定。结果表明构建了原核表达载体,pET30aNS5bpET30aNS5b明显表达出12-His-NS5b聚合酶蛋白。测序结果表明,与已发表的相关HCV NS5b RNA聚合酶序列比较,其核苷酸和氨基酸的同源性分别在69%~92.7%及88.8%~96.8%之间。在最佳表达条件下,可高效诱导表达融合蛋白(65kDa),最高表达量占菌体蛋白18.9%。Western-Blot结果显示表达蛋白为HCV NS5b酶。HCV聚合酶蛋白全长基因可以成功地克隆在pET-30a载体上并有效表达出目的蛋白,为研究建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型莫定了基础。 展开更多
关键词 丙性肝炎病毒 结构NS5b蛋白 基因克隆 原核表达 融合蛋白
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